版本信息：
Seurat v2.0不是3.0！现在Seurat更新了3.0版本，下载也是默认的3.0，这篇记录只适用于用2.0的。
梗概
- 将Cellranger中的基因表达矩阵filtered_gene_bc_matrices用于分析。
- 进行质量控制（QC），以删除异常细胞；
- 标准化与归一化，消除技术噪音与批次效应；
- 主成分分析（PCA）与挑选
- t-SNE聚类
参考网站：https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html
（注意！！！现在这个网站会自动跳转到3.0版本）
Seurat的安装：R中运行install.packages("Seurat")
上次结果：
经过Cellranger的数据整理之后，得到：
- Filtered gene-barcode matrices MEX: /outs/filtered_gene_bc_matrices
此输出结果应为基因-细胞的表达矩阵，用Seurat包进行后续分析。
Seurat是一种R包，设计用于QC，分析和探索单细胞RNA-seq数据。 Seurat旨在使用户能够从单细胞转录组测量中识别和解释异质性来源，并整合不同类型的单细胞数据。
运行R，并且加载这两个包
library(Seurat)
library(dplyr)
读取数据
spleen.data <- Read10X(data.dir = '/GRCh38/')
dim(spleen.data)
[1] 33694 1960
原始数据的基因数为33694，细胞数为1960.
比较普通与疏松矩阵的内存使用：
> dense.size <- object.size(x = as.matrix(x = spleen.data))
> dense.size
530488272 bytes
#转化为疏松矩阵，查看大小
> sparse.size <- object.size(x = spleen.data)
> sparse.size
45955656 bytes
> dense.size/sparse.size
11.5 bytes
初始化Seurat对象：
命令CreateSeuratObject
输入数据spleen.data
留下所有在>=3个细胞中表达的基因min.cells = 3；
留下所有检测到>=200个基因的细胞min.genes = 200。
(为了除去一些质量差的细胞)
spleen <- CreateSeuratObject(raw.data = spleen.data, min.cells = 3, min.genes = 200, project = "10X_spleen")
spleen
An object of class seurat in project 10X_spleen
15655 genes across 1959 samples.
剩下15655 基因和 1959 个细胞
质量控制
以下步骤包括Seurat中scRNA-seq数据的标准预处理工作流程。这些代表了Seurat对象的创建，基于QC指标的细胞选择和过滤，数据标准化和缩放，以及高度可变基因的检测。
mito.genes <- grep(pattern = "^MT-", x = rownames(x = spleen@data), value = TRUE)
percent.mito <- Matrix::colSums(spleen@raw.data[mito.genes, ])/Matrix::colSums(spleen@raw.data)
spleen <- AddMetaData(object = spleen, metadata = percent.mito, col.name = "percent.mito")
VlnPlot(object = spleen, features.plot = c("nGene", "nUMI", "percent.mito"), nCol = 3)
> par(mfrow = c(1, 2))
> GenePlot(object = spleen, gene1 = "nUMI", gene2 = "percent.mito")
> GenePlot(object = spleen, gene1 = "nUMI", gene2 = "nGene")
过滤细胞，根据上面的两幅图，去除异常值，这里选择基因数从300-5000，线粒体基因占比大于0.1的细胞。（主要看小提琴图1和图3）
spleen <- FilterCells(spleen, subset.names = c("nGene", "percent.mito"), low.thresholds = c(300, -Inf), high.thresholds = c(5000,0.10))
查看过滤掉剩下多少细胞：
spleen
An object of class seurat in project 10X_spleen
15655 genes across 1940 samples.
剩下15655个基因，1940个细胞。
数据标准化
加个log：
spleen <- NormalizeData(object=spleen, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
Performing log-normalization
0% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
spleen <- FindVariableGenes(object = spleen, mean.function = ExpMean, dispersion.function = LogVMR, x.low.cutoff = 0.0125, x.high.cutoff = 3, y.cutoff = 0.5)
Calculating gene means
0% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
Calculating gene variance to mean ratios
0% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
TEXT_SHOW_BACKTRACE environmental variable.
> length(x=spleen@var.genes)
[1] 1829
缩放数据并删除不需要的变体来源
您的单细胞数据集可能包含“不感兴趣”的变异来源。这不仅包括技术噪音，还包括批次效应，甚至包括生物变异来源（细胞周期阶段）。正如(Buettner, et al NBT，2015)中所建议的那样，从分析中回归这些信号可以改善下游维数减少和聚类。为了减轻这些信号的影响，Seurat构建线性模型以基于用户定义的变量预测基因表达。这些模型的缩放得分残差存储在Scale.data槽中，用于降维和聚类。
我们可以消除由批次（如果适用）驱动的基因表达中的细胞 - 细胞变异，细胞比对率（由Drop-seq数据的Drop-seq工具提供），检测到的分子数量和线粒体基因表达。对于循环细胞，我们还可以学习“细胞周期”评分（参见此处的示例）并对其进行回归。在这个有丝分裂后血细胞的简单例子中，我们回归了每个细胞检测到的分子数量以及线粒体基因含量百分比。
spleen <-ScaleData(spleen, vars.to.regress = c("nUMI","percent.mito"))
Regressing out: nUMI, percent.mito
|=========================================================================================| 100%
Time Elapsed: 18.0711550712585 secs
Scaling data matrix
|=========================================================================================| 100%
PCA分析
主成分分析是什么？
主成分分析，是考察多个变量间相关性一种多元统计方法，研究如何通过少数几个主成分来揭示多个变量间的内部结构，即从原始变量中导出少数几个主成分，使它们尽可能多地保留原始变量的信息，且彼此间互不相关.通常数学上的处理就是将原来P个指标作线性组合，作为新的综合指标。
将数据集降维，利用低阶的变量去反应整体的结果。
spleen <- RunPCA(spleen, pc.genes = spleen@var.genes, do.print = TRUE, pcs.print = 1:5, genes.print = 5)
[1] "PC1"
[1] "CD69" "CD79A" "TRAC" "CD3D" "MS4A1"
[1] ""
[1] "FCN1" "LYZ" "SERPINA1" "CSTA" "RP11-1143G9.4"
[1] ""
[1] ""
[1] "PC2"
[1] "CD79A" "MS4A1" "VPREB3" "CD79B" "HLA-DQB1"
[1] ""
[1] "NKG7" "CST7" "GZMA" "CD7" "CCL5"
[1] ""
[1] ""
[1] "PC3"
[1] "TRDC" "KLRF1" "MS4A1" "CD79B" "IRF8"
[1] ""
[1] "IL7R" "TRAC" "CD3D" "CD2" "CD3G"
[1] ""
[1] ""
[1] "PC4"
[1] "GIMAP7" "GZMB" "FGFBP2" "SPON2" "PRF1"
[1] ""
[1] "BAG3" "HSPD1" "FKBP4" "DNAJA1" "ZFAND2A"
[1] ""
[1] ""
[1] "PC5"
[1] "UBE2C" "TYMS" "MKI67" "TOP2A" "AURKB"
[1] ""
[1] "FCGR3A" "FGFBP2" "SPON2" "GNLY" "GZMB"
[1] ""
[1] ""
PCElbowPlot(spleen)
选择了前10个PC成分
spleen <- FindClusters(spleen, reduction.type = "pca", dims.use = 1:10, resolution = 0.6, print.output = 0, save.SNN = TRUE)
PrintFindClustersParams(spleen)
Parameters used in latest FindClusters calculation run on: 2018-10-01 21:59:55
=============================================================================
Resolution: 0.6
-----------------------------------------------------------------------------
Modularity Function Algorithm n.start n.iter
1 1 100 10
-----------------------------------------------------------------------------
Reduction used k.param prune.SNN
pca 30 0.0667
-----------------------------------------------------------------------------
Dims used in calculation
=============================================================================
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
细胞聚类
spleen <- RunTSNE(spleen, dims.use = 1:10, do.fast= TRUE)
TSNEPlot(spleen)
> saveRDS(spleen, file = "/spleen_1.rds")
将R变量保存，利于后续的分析。
一些补充：
过滤低质量细胞：
在 scRNA-seq 分析中，有些细胞质量比较低，比如细胞处于凋亡状态,细胞中 RNA 发生降解等,这些细胞的存在会影响分析，因此我们第一步需要对细胞进行过滤。主要可分为三类:
①利用细胞检测到的基因数或者是 reads 比对率来判断技术噪音。
但不管是基因检测数目还是比对率都跟实验方法有很大相关性。 如果比对率太低,表明 RNA 可能发生了降解,或者文库有污染或者细胞裂解不完全。
②如果实验中加入了 spike-ins（本实验没有），可以通过计算比对到内源性 RNA 和外源性 RNA(spike-ins)的 reads 比例来过滤低质量细胞。
比值偏低表明细胞中的 RNA 数量较低，细胞可丢弃。但是也需要注意其实当细胞状态不一样，比如处于不同细胞周期时，细胞的 RNA 数量是具有很大差异的。不过我们依然认为在一大群细胞中，spike-ins比例特别高的细胞在很大概率上应该被排除在外。软件 SinQC (Single-cell RNA-seq Quality Control)可以根据比对率和检测到的基因数来过滤细胞。
③根据整体的基因表达谱来定义技术噪音。
比如对细胞进行聚类分析，PCA 分析等，将 outlier 细胞删除，或者细胞表达中位值低于某一设定阈值时将该细胞过滤掉。当然这种方法也存在误删具有真正生物学差异的细胞,因此在删除细胞时需要小心，可与上述另外两种方法连用。
如果你的数据量过大，使用Seurat时内存不足，请看
实验记录11：海量scRNA-seq数据的质量控制、PCA、聚类
