8种特殊建库测序

8种特殊建库测序

8种特殊建库测序

1. RNA-seq

2. 外显子测序

3. small RNA-seq

4. 单细胞DNA测序

5. 单细胞mRNA测序

6. 甲基化测序

7.Moleculo长测序

8. Ribozero和方向性RNA文库

  1. RNA-seq

今天呐,主要是给大家介绍一下RNA-seq(RNAsequencing)。也就是RNA的高通量测序技术。

因为我们这个节目主要是针对医学方面的技术进展,所以,我们今天对于RNA的介绍,也会侧重于人的RNA测序方面的技术介绍,以及相关的生物信息学方面的工作。

RNA高通量测序(RNA-sequencing,缩写为RNA-seq)是目前高通量测序技术中被用得最广的

一种技术,RNA-seq可以帮助我们了解:各种比较条件下,所有基因的表达情况的差异。

它可以检测的差异有:正常组织和肿瘤组织的之间的差异;它呐,也可以检测药物治疗前后,基因表达的差异;它呐还可以检测发育过程中,不同的发育阶段,不同的组织之间的基因表达差异。诸如此类呐,很多。我们不一一列举。

那么在所有检测的差异类型中,最常见的,就是检测所有mRNA的表达量的差异,这是最常用的一种检测。

同时呐,我们还可以检测 RNA 的结构上的差异。例如:mRNA的剪接方式的差异,也就是我们一般说的“可变剪接”,还可以检测“融合基因”,同时还可以检测基因单点突变导致的SNP(Single Nucleotide Polymorphisom)。

接下来,我们分成“RNA-seq测序方法”和“RNA-seq测序数据分析”两个部分,分别介绍RNA-seq。

RNA测序方法

在测mRNA的过程当中,首先要解决的问题,是如何去除核糖体RNA也就是去除“rRNA”(Ribosomal RNA)。

那在通常抽提到的总RNA中,绝大部分都是核糖体RNA(rRNA)。以人类的细胞或组织为例,一般抽提到的总RNA当中,95%都是核糖体RNA。剩下的2%到3%是mRNA。还有呐,2%到3%是Long non-coding RNA、或者tRNA、microRNA,这些RNA,也就是说mRNA只占了所有RNA中的一小部分。

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如果我们把所有的RNA都拿来测序的话呐,测到的绝大部分的序列数据呐,都是核糖体RNA。而且这当中(rRNA)比例会高达95%左右,但是呐,核糖体RNA在整个人类当中都是非常保守的,而且在人的各个组织、器官当中也是极度稳定的。也就是说,测rRNA,它得到的数据,并不能为我们实验者提供什么有用的信息,而mRNA才是RNA当中信息含量最丰富的那个部分。

我们一般的RNA-seq要测的,也是mRNA的各种变化,所以呐,在实验过程当中,我们一般要把核糖体RNA先去掉。然后再进行建库测序。

去除核糖体RNA,并进行建库的方法,有许多种。

今天呐,我们主要介绍一下应用最广泛的illumina公司的TruseqRNA建库方法。其它的方法呐,以后我们再找机会再给大家做介绍。

那么这张呐,就是mRNA测序的建库过程图。首先呐,是利用高等生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点,用带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交。然后呐,Poly(T)探针呐,就和带Poly(A)尾巴的mRNA结合在一起,接下来呐就回收磁珠,然后呐把这些带Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。

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然后呐,再把这些洗脱下来的mRNA用镁离子溶液进行处理。镁离子溶液会把mRNA打断。

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被打断的这些mRNA片段,再用随机引物进行逆转录。

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逆转录成(第一链)cDNA后,再合成出第二链(cDNA)。这样就成为双链的cDNA。接下来呐,我们再在双链的cDNA的两端接上“Y”型的接头。这样呐,就成了标准的测序文库,然后呐,这个标准的测序文库就可以拿到HiSeq测序仪上进行测序了。

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样本质量要求

在这里呐要说明一下,这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。也就是说,只有在mRNA大部分是完整的状态下,才能得到比较好的效果。

这是因为带Poly(T)的磁珠,它所吸附的是Poly(A)的那些序列。那么如果mRNA发生了降解,也就是mRNA断掉了,那么磁珠所吸附下来的片段,都是那些靠近3'端的那些断片,而那些5'端的断片呢,是吸附不下来的。会在富集过程中被洗脱掉。

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那么这样呐,接下来的数据分析当中,就会发生一定的数据偏差。

那么为了保证能够测到尽可能完整的mRNA序列呢,Illumina公司是这样建议的:它建议先对总RNA进行一次质量检测,一般是用Agilent公司出品的Bioanalyzer 2100毛细管电泳仪,对总RNA样本进行一次电泳质检。那Bioanalyzer呐会根据18S和28S这两个核糖体RNA的电泳峰是否高、是否尖,来判断RNA的质量。并且呐,会自动打分。

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这两个峰越高、越尖,也就说明RNA的降解就越少,完整度呐就越高。那么打分呐,也会越高。反之呐,打分就会低。这个分值呐,叫“RIN”值。也就是RNA的完整度评分值。是“RNA Integrity Number”的英文首字母缩写。RIN值最高是10分,最低呐是0分。

Illumina公司推荐用RIN值在8.0以上的RNA进行建库和测序。测序完成之后呐,就可以进行数据分析了。

数据分析

分析的第一步呐,一般是先把测到的RNA片段,先mapping(比对)到基因组上,那么在比对完了之后呐,可以先看一下,有多少的RNA片段,是在靠近基因的5'端的位置,又有多少片段在是靠近基因的3'端的位置。

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那么这张图上呐,就是把所有的基因,都按其外显子的长度呐,拉直,然后呐,归一化到“0 - 100”的这样一个长度。然后呐来看,比对上的片段,有多少是落在这0到100的这一个轴的哪个位置上。

这样一个比对的结果,就可以让我们看见前面Poly(T)磁珠在抓mRNA的时侯。

捕获下来的这些mRNA是不是完整的,如果捕获下来的这些mRNA大部分是完整的话呐,那么这个图形靠近5'端的曲线就会显得比较饱满。它的高度会和3'端的高度差不多。

反之,如果这根曲线的3'端是很高的,而5'端是比较低的,我们就可以初步判断,这个RNA有一定程度的降解。

因此,我们可以推断在捕获过程当中,有相当一部分(mRNA),它的5'片段因为与3'片段的Poly(A)片段的尾巴断开了,所以,没有被捕获下来。所以,这个RNA呐,是有一定程度降解的。

在知道了测序的质量之后呐,接下大家来要关注的就是不同样本之间、各个基因的mRNA的表达量的差异。

RPKM 指标

那么在做这些比较的过程当中,目前最常用的,对基因表达量进行相对定量的一个指标,就是RPKM值。那么RPKM呐,是Reads Per Kilobase of exon model perMillion mapped reads的英文的首字母缩写。

RPKM翻译成中文呐,就是每一百万条可以比对到基因组上的Read当中,有几条是可以比对到某个特定基因的,

然后呐这数值再除以该基因的外显子的长度,得到的这样一个最终的比值。

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这个公式呐,就是这样的。

它的分子呐,就是经对到某个基因的外显子的read数。它的分母的第一项呐,就是这次所有比对到基因组上的read数(M reads,MillionReads)。分母的第二项,就是这个特定基因的外显子的长度。

我们接下来分步地对这个公式进行一下解释,首先呐,就是比对到某个基因的外显子上

的Read数,去除以这次所测到的、全部可以比对到基因组上的Read数。这个比较容易理解就是:这个基因所表达出来的mRNA,它所被测到的片段,来和所有被测到的、可以Mapping(比对)到基因组上的片段来进行比较。这点是比较容易理解的。

那么这个比较费解的是,为什么还要除以第二项,就是“除以这个外显子的长度”。这是因为建库过程当中,这个RNA是用镁离子溶液来处理,

然后打断(并逆录)成若干个180-200BP左右的小片段,如果一个基因的长显子越长,那么它所产生的mRNA就越长,那么mRNA越长呐,被打出来的小片段就越多。

我们来假设,一个A基因,它的mRNA的长度呐,假设它是1Kb,那么它的1Kb的mRNA可能被打成“5”个,200Bp左右的小片段;那么还有一个B基因,如果这个B基因的mRNA是2Kb长,那么,它同样被打成200Bp左右的小片段呐,它就会产生“10”个小片段。

我们来看,A基因是5个小片段,而B基因是整整10个小片段,所以,B基因在测序过程当中,它被测到的概率就会比A基因整整大出去一倍。

这就是我们为什么要把刚才第一项比出来的比值呐,然后再除以这个外显子的长度。

通过上面的解释呐,我们就可以理解:除以这个外显子的长度,它的目的:是修正这个mRNA长度所引起的mRNA的Read数的偏差。

通过这种修正呐,能够还原出一个比较真实的、原始的表达拷贝数状态。

这个呐,就是“RPKM”定义的原理。

火山图

那么作为一种针对全转录组的分析,我们希望是一次看到一个整体的样本(表达)差异的情况。而不仅仅是看少数几个基因的表达差异。

科学家做了一种叫“火山图”的一个图形,来比较形象地来说明2个样本之间的表达差异。

那么我们来看这张图,这张图呐,这个样子就象火山喷发的样子,那么这个图呐,是2个样本的RNA的表达量的对比。

这个图的横轴呐,是表示某个基因的表达是上升了,还是下降了。

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纵轴是表示这种差异的置信程度,这其中的每个点呐,就是两个样本当中同一个基因的mRNA表达量的变化。

如果这个基因的表达是上调了,那么这个点呐,就往右移动。反之,如果这个基因的表达量是下调了,那么这个点呐,就往原点的左移动。

那么这个纵轴呐,就是这种变化差异的置信程度。如果这个置信程度越高呐,那么这个点的纵轴位置也越高。

那么我们在纵轴上划了这样一条水平线,超过这个水平线以上的(点)呐,(其差异水平的)置信程度是很高的。我们就把它标示成红颜色。如果低于(这条水平线的)置信程度呐,它的置信程度也相对低一些,我们把它标成蓝颜色。

这里要解释一下,为什么差异程度是相同的情况下,它们的差异置信程度是不一样的。比如说同样是差了2的5次方,也就是32倍,它的差异置信程度会不一样,有些是蓝点,有些是红点。

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A基因在甲样本中,被测到了3200条,而在乙样本中被测到了100条;B基因在甲样本中,被测到了320条,而在乙样本中被测到了10条。它们同样是差了31倍,但是因为A基因的样本统计数,远大于B基因的样本统计数,也就是说,它们的Reads数有那么大的差距。

所以,A基因的这个差异的置信程度,会比B基因的这个差异置信程度要高许多。

那么,我们再来对比这两张图。那么就可以比较直观地发觉,左侧的这个图当中,有更多的基因表现出明显的差异,这样呐,火山图就为我们提供了一个形象的、直观的、整体表达差异信息。

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聚类分析图

聚类分析呐,是RNA分析中非常常用的一个手段。它呐是通过多个样本的全基因表达谱对比,

来找到它们之间的相似性,和相近关系。

这是一张聚类分析的图,横轴呐是样本,纵轴呐是基因。通过聚类分析呐,可以发现:在这个群体中,样本被分成了3个群体。

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每个群体的内部呐,都有着相似的表达特征。同时,我们还可以看到,基因的表达,也是成簇的,这儿呐大体上分成3个基因群。那么这3个基因群呐,各自有着相似的表达量。

聚类分析呐,有很多的应用,比如说:我们可以分析疾病的亚型。

那么还可以通过对多个基因在特定疾病当中的表达倾向性呐,来找出可能的、新的、诊断用的Biomark。

聚类分析,有很多新的应用,有待我们一一去开发。

GO分析

GO分析是RNA-seq分析中非常常用的一种分析。GO是Gene Ontology的缩写,GeneOntology呐是一个国际化的、基因功能分类体系。这个体系用一整套动态更新的标准词汇、和严格定义的概念,来全面地概括任何生物中基因和基因产物的属性。

GO主要描述基因的三个属性:

第一,是这个基因,它参与的生物过程

第二,是这个基因的产物的功能

第三、是这个基因产物在细胞器内的空间定位

差异基因GO富集柱状图:可以直观的反映出在生物过程、细胞组分、和分子功能富集的差异基因的个数分布情况。

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有向无环图,是差异基因GO富集分析的图形化展示方式,从上到下呐,它所定义的功能范围越来越小、越来越精准。

它的分支呐,表示包含关系。而这个圈圈的颜色越深呐,表示这个富集关系程度越高。

Pathway分析

通路分析:通路(Pathway)是指在系统水平上完成生物的某一功能的基本单元、或者局部子网络。

KEGG,也就是:Kyoto Encyclopaedia of Genes andGenomes。翻成中文:就是《京都基因和基因组百科全书》,是目前公认的、最权威的基因功能数据库。

这其中的Pathway(通路)是KEGG的核心内容。

目前针对Pathway的分析、注释,大多数是基于KEGGPathway来做的。

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散点图是KEGG富集分析结果的图形化展示方式。

在此图中,KEGG富集程度通过Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因个数来衡量。

点的面积越大呐,则富集的基因数越多。

富集的因子越大呐,则表示富集的程度越大。

qValue呐,是校正之后的pValue。那么它越接近于0呐,表示富集程度越显著。

结构变异分析

前面,我们讲的都是基于RNA表达量的差异分析。

接下来呐,我们要说一下,RNA-seq当中,可以测到的mRNA上的各种结构上的变异。

所谓结构上的变异呐,也就是RNA序列的变异。

主要呐,是3种:

第1种,是可变剪接

第2种呐,是融合基因

第3种呐,是点突变,也就是SNP

结构分析需要较深的测序深度

这里要说明一下,对于想要测mRNA结构变异的用户呢,建议测序深度要测比较深。

我们一般呐是建议测10G以上的数据量。那么为什么要测这么多的数据量呐?原因是二代测序,目前的测长还不是很长,每一个Read呐,只有大约100到125个Bp左右。如果测序深度不够呐,那么读到的这些read在整个的mRNA上的分布呐,是一种比较零碎的一种状态。

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那么在这种比较零碎的、不完整的覆盖情况下,要去分析哪里有一个剪接点,哪里有一个断点,哪里有一个SNP,它不是很准确的。

当测序深度足够深的时侯,在每一个位点,都有10几次、或者几10次的覆盖的时侯呐,我们就可以比较有把握地来判断出,哪儿有了一个新的剪接点,哪儿出现了一个断点,哪儿,碱基发生了突变。

可变剪接

可变剪接,在真核生物中普通存在。一般一个人的组织样本当中呐,可以通过高通量测序,发现有5000个到20000个左右的可变剪接。

融合基因

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融合基因呐,是指原来在基因组上分开的2个基因,因为某种原因,染色体发生了重排。

重排的结果呐,是让A基因的头,接到了B基因的身体上,这样就产生了融合基因。

那么这张图呐,就是一个癌细胞中的融合基因的示意图。

接下来这张图呐,是高通量测序测到融合基因的这个图。我们可以看到这10几个Reads都横跨在这个融合基因的、交接点的两侧,由此呐,证明了这个癌细胞当中有这么一个融合基因。

点突变

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RNA-seq呐,还可以找出点突变,这个呐,是一张泡泡图,来表示我们所找到的点突变。

发生突变频率最高的这个基因,就用最大的泡泡来表示。(突变)频率低一点的,就画一个小一点的泡泡(频率),再小一点,那么再小一点的泡泡。

这些泡泡呈逆时针排列,形成这样一个泡泡图。

  1. 外显子测序

今天,我们会和大家谈一下人外显子组测序的方法原理。和它能够给我们带来哪些有用的生物信息。

那我们还是分两个部分来介绍,第一个部分呐,介绍外显子测序的技术方法。第二个部分,我们来介绍外显子测序可以得到哪些有用的生物信息。

实验原理

那么,我们先来说外显子测序的工作原理。

我们先来看这张图,外显子测序的核心技术呐,是这(些)个针对人外显子序列设计的捕获探针库,那么这些探针的序列呐,都和人外显子的DNA序列相互补。

在实验过程中呐,它可和人的外显子DNA序列进行杂交结合。同时呐,这些探针都标上了生物素。

有了这个捕获试剂盒呐,就可以进行建库、和捕获了。

第一步呐,是先把基因组DNA进行超声打碎,建成DNA文库。

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第二步呐,是把建好的文库和探针库进行杂交。

杂交过程中,通过核酸序列的互补结合的原理,探针会和目标DNA片段进行结合。

然后呐,再用结合了链霉亲和素的磁珠,与这个杂交混合液呐进行混合。

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因为链霉亲合素是会和生物素牢固结合的。

这样,就把我们要捕获的外显子目标片段,通过探针,间接地结合到了磁珠上。

然后呐,通过磁铁把这些磁珠给吸附下来。

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而把上清液呐给去掉。

这样呐,也就把没有结合的DNA片段给洗掉了。

再接下来,用洗脱液,把我们要的DNA文库从磁珠上给洗脱下来。

那么这些文库呐,再经过PCR扩增,就可以上HiSeq测序仪进行测序了。

测完序以后,就可以进行生物信息学的处理了。

数据分析

那么先是把这些测序的DNA片段比对到人的基因组上。

然后呐,把这些比对到基因组的序列进行突变分析。

覆盖深度

一般用Agilent SureSelect 50M的试剂盒进行外显子建库、捕获。再用HiSeq 2500 V4 PE125的方法进行测序,测10个G的数据量。大约可以得到95X的“有效测序深度”。我们说的有效测序深度(effective sequencing depth)是相对于总测序深度来说的。

总的测序深度呐,是把所有测得的数据(量)去除以目标区域的大小。

举例来说,用Agilent 50M的这个试剂盒,我们测到10个G的数据。

去除以目标区域的50M的大小,那么得到的是200X的测序深度(10G/50M = 200X)。

但是这个200X的测序深度,对于做生物信息学分析来说呐,并没有太大的实在意义。

因为当中还要扣掉许多无用的数据,才能得到有效的数据。

在外显子测序中,要扣掉4种因素引起的无效数据。

第一个影响因素呐,就是因为杂交捕获的过程它不是十分精确的,基因组中的有许多序列,

是和外显子有一定的同源性的。那么这些片段呐,在杂交过程当中,也会被杂交捕获下来。而这些片段呐,不是基因的外显子。

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所以,我们在分析过程当中,首先要把这些序列给去除掉。

第二个影响因素呐,是捕获下来的一个片段,很可能它(只有)一部分的序列是落在目标区域还有一部分序列呐,是突出在目标范围之外的。那么,这部分突出来的序列呐,它不是目标区域,所以,它也不计入外显子测序的“有效测序深度”。

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这个落在目标区的数据,占全部被测到的数据的比例,我们用一个专业术语来称乎它,叫作

“捕获效率”(capture efficiency)。那么AgilentSureSelect这个试剂盒呐,它的捕获效率,大约是65~70%。

第3个影响有效数据比例的因素呐,是Duplication。那么所谓duplication呐,就是建库过程当中它的最后一步,是通过PCR扩增把原始的模板,扩增出几百倍来。那么由同一个模板分子扩增出来的子文库分子呐,是长得一模一样的那么这些多出来的这些分子,如果被重复地测到它并不能为我们提供太多有用的生物信息。所以,我们在生物信息分析的过程当中,

我们要去掉这些重复的片段。

那么要去掉这些重复的片段我们判断的依据是:2个DNA分子它们的5'起始位置、和3'的结束位置,完全一模一样,那么我们就认定这2个分子,是从同一个母分子,PCR出来的(2个)子分子。

然后呐,我们会比较这2个序列的数据质量,留下那个数据质量比较高的,去掉那个

数据质量比较低的,这也就是我们通常所说的“去Duplication"的过程。

用Agilent SureSelect试剂盒进行建库、捕获,实测10个G的数据,我们发现duplication大约在5%左右。

那么,我们说明一下,duplication的比例不是恒定不变的。而是会随着测序深度的增加、而增加,因为上机(测序)的文库是经过PCR扩增的文库。

随着测序量增大,那么测到源自同一个模板的PCR子分子的概率呐,就会提高。

第4个影响因素呐,是目前主流的测序方法是HiSeq V4 PE125这种方法。也就是:双端各测125个碱基,那么Agilent的建库方法中当呐,插入片段是150~200BP,这样一个大致范围的这些片段,那么它的平均片段长度呐,是180BP。那么我们用双端125的方法来测序就会导致左边的这个reads(序列)和右边的这个reads(序列),读到当中,会有一段,大概会有70BP的交叠。

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那这个70BP的交叠的序列,是冗余的序列。也就是说,我们读了250个BP的序列,但是

其中大约有效的呢,是180个(BP)。有70个BP呐,是冗余的。

综合上述4项因素,我们可以看到,用AgilentSureSelect 50M的这个捕获试剂盒进行建库、捕获,并且用HiSeq V4 PE125的测序方法来测序,测10个G的数据量,那么可以得到,大约95X的有效测序深度,(10 * 0.7 * 0.95 * 180 / 250 / 50 = 95)。

覆盖均匀性

除了测到的有效数据量之外,还有一个因素会影响到后面的分析,这就是Reads的分布均匀情况,也就是说目标区域的每个碱基被覆盖的深度的均匀性。那么这个结果呐,是越均匀越好。

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科学家经过实测,发现Agilent的SureSelect、和Roche的Nimblegen,这两个捕获试剂盒,所得到的覆盖均匀性是比较好的。

在肿瘤测序中的优势

外显子测序,可以测Germline突变(胚胎形成时就带有的突变),也可以测体细胞突变(Somatic Mutation),但是呐,随着Illumina推出HiSeq X10测序仪,把人全基因组测序的直接成本降到1000美元以下,那么Germline水平的突变呐,已经很少用外显子来测了。

目前,外显子测序的主要优势就体现在肿瘤基因测序方面,之所以外显子测序在肿瘤基因测序方面有优势呐,这是因为外显子测序,它的测序深度,可以比较容易地做到“深度”测序。那么呐,它可以比较轻易地达到100X、200X,甚至更深的测序深度。这个呐,就有利于测到 low allele frequency (低等位基因频名优新)的体细胞突变。

因为肿瘤中的突变呐,往往都是 low allele frequency 的体细胞突变。所以,外显子组测序就在测肿瘤基因组突变方面,显出比较明显的优势来。

那么如果是要测肿瘤中的体细胞突变呐,一般是拿手术切下来的肿瘤组织DNA、和病人外周血中的白细胞基因组DNA,进行外显子测序。

一般肿瘤的测100~200X的深度,白细胞的(DNA)测100X的深度。从白细胞DNA得到这个病人的Germline基因组序列,拿肿瘤的DNA序列与之做对比,找出其中的体细胞突变。

SNP信息

外显子组测序,主要能够得到的信息是点突变,也就是SNP信息,和插入缺失突变,也就是Indel信息。这张图呐,就是找到的体细胞突变的泡泡图。

在这个泡泡图中,突变频率越高的基因,就画一个大泡泡,放在图的中间。突变频率低一点的基因,就画一个相对小一点的泡泡,延着逆时针排列。再低频的突变,再画一个再小的泡泡,再在外面再排列下去。依此类推,就得到这样一个泡泡图。

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泡泡图有利于我们非常直观地看到样本中体细胞突变的情况。

GO 和 Pathway 分析

找到突变之后,就可以进一步地做GO和Pathway分析。

关于GO和Pathway的定义,我们已经在前一期讲RNA-seq的节目当中,给大家介绍过了,想要了解的朋友可以在优酷中找一下:【陈巍学基因】视频7:《RNA-seq方法和应用》这一集。自己去看一下。

那么,我们来说GO分析。

这张图是GO分析的结果。

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这是根据突变的点在肿瘤中的富集的情况做的分析。

分成“细胞组件”、“分子功能”、和“生物过程”3个大类,进行展示。

柱子越高,则表示这个亚类当中突变越多。

这是有向无环图,它把突变进一步一步富集到更精细的小概念当中进行展示。

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这个图中,是越向下,它的功能就划分得越精细。同时颜色越深的块块,则表示突变在

这个小概念中富集程度越高。

这是Pathway的KEGG富集分析。它吶,可以帮助我们看到哪些通路发生了显著的变化。

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更深一步的分解分析,则让我们深入地看到突变的基因在整个通路中所处的节点。

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让我们更好地探索突变和病变之间的关系,我们要说明:在外显子测序的数据分析当中,对基因组的结构变异是不敏感的。

不敏感的原因是外显子测序,只测了基因组上很小一部分区域,这个比例小到了只有1~2%

,所以当结构变异的断点,不落在外显子区域的时侯呐,外显子测序是看不到这些断点的,所以我们说:外显子测序对基因组的结构,变异--SV(Structure Variation)呐,是不敏感的。

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对CNV不敏感

外显子测序对拷贝数变异(CNV,copy numbervariation),不是很敏感。不敏感的原因呐,是因为杂交捕获过程啊,是一个含了很高偶然性的过程。

也就是说,一个外显子片段上,它有多少个reads(序列)被捕获下来,样本和样本之间是有很大差异的。

或者说,它的覆盖度,本来就是忽高忽低的,因为有这种忽高忽低呐。

这就导致:一个外显子上测到的Reads数变高,或者变低。

我们很难判断,是因为这种偶然性呐,还是因为拷贝数发生了变异。所以,外显子测序,对于小片段的拷贝数变异,它本身是不敏感的。

但是,如果基因组上发生了大片段的拷贝数变异。比如说,长度在5M(5M base pair)以上的

片段发生了拷贝数变异。那么外显子测序呐,是可以发现的,这是因为这样长的片段当中呐,一般含有多个外显子。当多个外显子的测序Reads数都发生了改变,那么,它就会有统计上的显著性。通过这种统计上的显著性,我们可以来判断:基因组上的确发生了拷贝数变异。

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因为外显子组测序对结构变异和拷贝数变异不敏感,所以,在实际的肿瘤基因测序中呐,科学家往往是这样做的:用全基因测序来找到肿瘤样本中的结构,变异(SV)和拷贝数变异(CNV),再用来外显子组测序来找肿瘤样本中的、低频的SNP和Indel体细胞突变。

捕获Panel测序

今天,我们在讲外显子组测序的同时呐。我们就顺带说一下针对某些疾病所设计的捕获Panel测序,所谓Panel,往往是指对若干个基因设计一个捕获试剂盒。

诊断公司为诊断特定的疾病,设计了许多特定的、针对性的Panel。

例如著名的肿瘤诊断公司Foundation Medicine就设计了“Foundation One”这个Panel。

它(Foundation One)是针对实体瘤的一个Panel,这个Panel包含了315个经常发生突变

的肿瘤相关基因。还包含了28个经常发生重排的基因。

这一类的Panel,它的建库、捕获、和测序原理,与外显子组测序是完全一样的。

但是因为它所选择的基因数远少于外显子,所以就可以用较少的测序量得到非常深的测序深度。

同时因为测序数据量较小,所以数据分析的难度也会小许多,耗时也会更短。这对于临床诊断所需的快速响应呐,是有十分多的好处。

3. small RNA-seq

今天要给大家介绍的是:small RNA-seq,也就是“小RNA的测序”。

那么,小RNA呢,包括了micro RNA/tRNA/piRNA等一系列的、片段比较短的RNA。其中,micro RNA因为其基因数量众多,同时,表达量变化丰富,是近10年来的一个研究重点,我们今天分2部分来介绍samll RNA测序。

第1部分是介绍small RNA的建库测序方法。

第2部分是介绍small RNA的生物信息学分析。

建库方法

那么,我们先说第1部分,small RNA建库。

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这张图是small RNA建库的流程图。

在small RNA的结构上,都是5’端有一个磷酸基团,在3’端有一个羟基基团。

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在建库过程中,先在它的3'端连上一个3'端专用的接头。然后,再在5'端连上一个5'端专用接头。

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然后进行逆转录,得到第一链的cDNA。

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接着再进行PCR扩增

这样就得到了双链的测序文库。

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这张图,就是建好的small RNA文库。

用Agilent Bioanalyzer 2100进行电泳,得到的电泳图。

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如图所示,扩增之后得到的small RNA的文库。

在整个的扩增混合物中,只占很小的一个比例。

所以,一般情况下,这个文库还要经过进一步的电泳胶分离。切胶回收,才能得到比较纯的、我们要的small RNA文库。

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纯化好的文库,再用Agilent Bioanalyzer 2100进行电泳。

我们就可以看到比较纯粹的small RNA文库了。

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目前用illumina Truseq small RNA建库试剂盒。

对组织中抽提到的总RNA进行small RNA建库。

一般一个反应需要1微克的总RNA。

同时small RNA建库,对(总)RNA的质量也会有一定的要求。

一般是要求总RNA的RIN值大于等于8.0。

关于RIN值(RNA Integraty number,RNA完整度值)的意义,如果观众有不清楚的,又想要了解的,可以在优酷视频当中找一下【陈巍学基因】《视频7:RNA-seq》,里面有专门的介绍。

生物信息分析

接下来,我们介绍第2部分:small RNA的生物信息分析。

small RNA生物信息分析的第1步,是把测序的序列进行过滤。

也就是把引物二聚体、和含有多个N的这些序列去掉。

然后,就是统计各种长度的small RNA各有多少条。

一般情况下,人源组织所测到的small RNA会在22BP左右有一个主峰。这个主峰就是micro RNA,同时,30BP左右又会有一个副峰,这个峰,主要是piRNA。

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接下来,就是把small RNA,比对到参考基因组上。

在参考基因组上比对好之后,就可以把这些序列和已知的small RNA数据库进行比对了。

比较有名的small RNA数据库是miRBase,这个数据库目前这个数据库已经收录了2000多条人源的micro RNA基因。

在对人源样本的测序过程当中,大家最关心的主要是micro RNA和piRNA,这2种small RNA。那么在测序过程当中,实际上还会测到rRNA的碎片和tRNA的序列。

因为rRNA和tRNA在人的基因组中是十分保守的,所以一般不是我们关注的重点。

对表达量的分析

对已知small RNA的分析,主要是对表达量的分析。

small RNA的表达量,一般用TPM来衡量。TPM是Transcripts Per Million reads的

缩写。

也就是1百万条测到的序列当中,某个目标small RNA的序列条数。

TPM的密度分布图,能整体展示样本的small RNA基因表达情况。

图中,横轴是一个small RNA基因的表达量。越向右呢,则这个基因的表达量越高。纵轴是有特定表达量的基因数量,越向上,则基因数目越多。

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从这张图上可以看出,少量的基因有高表达,大多数基因的表达量,还是相对偏低的。

用火山图,则可以整体地观察两个样本之间的表达差异。

火山图的横座标,是某个small RNA基因的表达的增减。从0向右,则表达量上升,从0向左,则表达量下降。纵轴则是表达量差异的显著性,越向上,则差异越显著。

一张火山图,可以让我们轻松地观察2个,样本之间,small RNA的表达差异。

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聚类分析,则可以帮助我们直观地观察,一批样本当中,那些样本有共同的表达特征。又有哪些small RNA基因有相似、相近的表达量。

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如这张图中所展示,样本经过聚类分析,明显地可以看出,其small RNA的表达谱,呈现2种表达情况,上绿下红的样本呢,自然地被分到了一组,上红下绿的样本呢,就会被自然地分到另外一组。

通过聚类分析,我们可以观察到样本内在的共同特征。

在人类细胞中micro RNA主要是通过和mRNA结合,来阻止mRNA翻译成蛋白,从而起到抑制靶基因表达的作用。目前,只有少数的micro RNA和靶基因mRNA的对应关系是经过了实验验证的。大多数还是通过序列互补、结合热稳定性等预测性手段来预测的。

所以,这些关系不是很精确的。虽然这种预测不是很精确,但是它能为我们的科研提示有用的研究目标。

靶基因 GO 和 Pathway 分析

接下来,我们说一下micro RNA侯选靶基因的GO分析、和KEGG Pathway(通路)分析。

GO分析和KEGG Pathway分析是非常常用的生物信息学分析手段。

想要了解这2种分析的基本情况的同学,可以在优酷中找一下【陈巍学基因】《视频7:RNA-seq》去看一下。

通过GO分析,表达差异被富集到分类的GO的子项目当中,通过这个图,可以看到“生物过程”、“分子功能”、和“细胞组件”的哪些环节出现了明显的差异。柱子越高,则表示差异越明显。

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有向无环图,是进一步把差异一步一步地富集到更精细的小概念当中进行展示。

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在这个图当中,越向下,功能就越是细分。同时,颜色越深的方块呢,则表示差异在这个小概念当中,富集程度越高。通过对表达差异的micro RNA和它对应的靶基因进行KEGG分析,

可以把可能被影响到的通路进行富集分析。

这个图,就是KEGG分析的结果。在此图中,KEGG富集的程度,通过富集因子、Qvalue、和富集到此通路上的基因个数,来进行衡量。

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点的面积越大,则富集的基因数越多,富集因子越大,则表示富集的程度越大。

接下来这个通路图,是对某个特定通路的进一步的细化分析。

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它可以让我们看到,在一个整体的通路中,具体是哪个、或哪几个节点会有显著的差异。

寻找新的 micro RNA 基因

寻找到新的micro RNA基因。一般是测序测到新的、有发夹结构的microRNA前体的序列,同时测到对应的成熟的micro RNA序列,并且在基因组上又找到了对应的基因序列,这样,大体上就判断(可能是)找到了一个新的micro RNA基因了。

以上,我们说的都是组织中的small RNA的测序和分析。

血浆 micro RNA 测序

随着技术的持续进步,目前用血清、或者血浆中的micro RNA来诊断疾病,成为诊断医学十分关注的一个研究方向。这是因为:

  1. 血清当中有大量的、种类丰富的micro RNA。并且这些micro RNA可以相对稳定地存在

  2. 同时我们已经知道micro RNA参与多种基因的表达调控

  3. 血液又是我们最容易获得的诊断样本之一

  4. 而且,目前血清、或者血浆中的micro RNA已经可以被方便地测到

所以,许多学者都在研究血清micro RNA,以期望从中找到新的诊断Biomarker。

目前,做一个血清micro RNA测序,大约只需要0.5毫升左右的血清、或者血浆。

也就是相当于1毫升的原血就够了。

用于micro RNA测序用的血清、或血浆,可以用3倍体积的Trizol LS来进行保存。也就是说,0.5毫升的血清,加上1.5毫升的Trizol LS。混合均匀之后呢,-20℃、或-80℃保存。然后,通过干冰运输,交给专业的测序公司,就可以进行测序、分析了。

  1. 单细胞DNA测序

今天,和大家谈一下单细胞测序。

自从二代测序技术出现,把一次实验测许多条DNA序列的这个难题解决之后,一次把一个人的全基因组给测出来,最极限的情况,就是样本量就是少到一个细胞,就要测出整个基因组的序列信息。

三个难题

要实现从一个细胞样本测出全基因组的DNA序列,至少要克服以下3个难题:

第1个,就是如何实现均匀扩增,也就是说,用传统的随机引物PCR的方法来扩增。那么不同扩增片段的扩增效率多少会有一些差异,这些扩增效率的差异会随着扩增循环数的增加,呈现出指数放大的效果。其结果就是会发生严重的覆盖不均一,极少数区段的DNA被大量扩增,测序后它深度非常深,但在大多数区段只有很低的覆盖,甚至没有覆盖。那么我们就无法有效地判断那些低扩增效率区段的基因序列的情况。

那么它的第2个难题,就是 全基因组覆盖问题。常规的、用大量DNA进行建库的方法,因为打断、补平、加A、加接头等一长串的操作,每一步都会有DNA片段的损失。结果就是初始DNA中很大一部分会被浪费掉,而没有形成有效的文库分子。

在单细胞测序中,丢失大部分的起始DNA,是不可接受的。单细胞测序要求几乎所有的原始基因组片段都得到扩增,并且在后续的测序过程中被测序测到。这就要求几乎所有的片段,都会被得到扩增,而不只是少数片段得到有效扩增。

第3个难题,是这种方法要有较高的扩增效率。建好的文库,在HiSeq测序仪上机的时侯,大约每上机2万个文库分子,只有1个文库分子,是能够在测序的Flowcell表面生成簇,并且被测序测到的,剩下的大多数文库分子,在上机的时侯是被水冲走的。所以,单细胞基因组扩增的方法,还要有较高的扩增效率。至少要有上万倍到几十万倍的扩增效率,才能保证在全基因组测序的时侯,大部分的片段都被测序测到。

两种方法

为了解决上述的难题,科学家想了许多的办法。

到目前为止,大家比较认可的方法有两种:

第一种是MALBAC方法。

第二种是MDA方法。

MALBAC方法

我们先来说这个MALBAC方法。它的全称是:MultipleAnnealing and Looping-Based Amplification Cycles。是谢晓亮教授发明的方法,

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这张图是MALBAC方法的示意图。这个黑色的线条,就是基因组模板DNA,这些红颜色的线条就是扩增引物,扩增引物的5’端有27个碱基的通用序列,这些通用序列会作为未来的PCR通用扩增引物的结合序列。扩增引物的3’端有8个随机序列的碱基,这8个碱基可以随机地杂交到基因组DNA的互补序列上。

这些灰色的椭园是Phi 29 DNA聚合酶,Phi 29 DNA聚合酶有一个特点,它不仅可以生成新的DNA链,它还能把之前已经合成好的DNA链给解链开。

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再形成自己的新链,这个特点能够把每个循环所能合成的DNA新链的数量提高几倍、甚至几十倍、上百倍。

接下来,就是做5个MALBAC循环,请注意,这里每个循环的最后一步是58度退火。我们后面要详细解释这一步58度退火的作用。

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第一个循环下来,得到的是一批5’端有通用扩增序列的DNA片段。

在第二个循环完成后,所产生的扩增产物中,大部分是5’端有通用序列。而3’端,有与通用序列互补的序列的这些片段。

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图中的这4个步骤,一共重复5次,这样做的巧妙之处,就是要解决我们刚才所说的3个难题。

第一、是要均匀扩增

第二、是要全基因组覆盖

第三、是要有高的扩增效率

那么,我们先来看这个线性扩增。

刚才,这个MALBAC方法的巧妙之处,就是在每个循环的最后,加了一步58度退火,这一退火过程,它让完整扩增的产物,它的两端发生链内杂交。这样,3’端的序列就不能与新的、游离的引物发生杂交。这也就不会引新的、发起始于3’端的扩增,这样,就避免了完整扩整的产物的自我指数扩增。

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现在,还是8个随机序列的引物在模板上随机地找结合位置,所有的位点都有一样的机会被扩增。

那么,这样实际得到的产物分3种:

第1种,就是m* n 个“完整扩增产物”,这是最主要的产物。这里“m”就是循环的次数, “n”是一个循环中,有多少个扩增,引物可以粘到一个模板上。

第2种扩增产物,就是(m+1)* n个“半扩增产物”,第3种DNA,就是那个原始的DNA模板,这里完整产物的数量是“m*n ”,也就是说,扩增产物(的数量)与扩增的循环次数“m”成正比,而不是与m的平方成正比。更不是与2 的M次方成正比。

这也就是达到了,我们想要的“线性扩增”的目的。也就是说扩增产物(的数量)与扩增的次数成线性关系。这就达成了我们单细胞测序当中第1个要求“线性扩增”。

第2个要解决的难题,就是“全基因组覆盖”

这里,是利用Phi 29聚合酶的能一次在模板上聚合出多个新链的功能来达到这个目的。

在5轮的扩增之后,每个模板都会有5*n^2个扩增片段。这样,就可以保证建库时大多数的

基因组区域可以被建成文库,最后,可以被(测序)测到。

第3个要解决的问题“高效率扩增”。还是利用了这个Phi 29酶的一次得到多个扩增片段的这个效果,来达成的。

上面所说的,就是MALBAC单细胞扩增技术的基本原理、和它的巧妙之处。

MDA方法

目前市场上还有一种单细胞的扩增技术,叫MDA扩增技术。它的全称是MultipleDisplacement Amplification。

MDA方法的技术核心是用Phi 29 DNA聚合酶来进行直接的扩增。

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Phi 29酶的特点是,它可以把双链DNA进行解链,然后,在常温条件下,就把原始模板进行大量扩增。

两种方法的比较

把MDA和MALBAC两种方法进行比较

MDA的优势在于,它的扩增效率更高,并且,实验方法更简单。

MALBAC方法的特点,在于它的扩增均一性更好。但是,它得到的扩增DNA量相对较少,或者说,它的扩增效率相对比较低。

这张图是:大量细胞测序、MDA方法测序、MALBAC方法测序,这三种测序结果的Lorenz曲线。

Lorenz曲线是越接近于对角线,则覆盖越均一,从图中,我们可以看出大量细胞测序,它的均一性是最好的。

用MALBAC方法测序,它的均一性比大量细胞测序的均一性要差一些,但是要比MDA的方法的均一度要好。

这张图是用三种方法来测肿瘤细胞中的拷贝数变异。其中横轴是染色体的序列,纵轴是测序的覆盖深度,可以明显地看到,在大量细胞测序的结果中,可以非常直观地看到拷贝数变异的情况。

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而用MALBAC的方法,也还是能够比较清楚地看到拷贝数变异。但是,它没有大量细胞测序的结果那么清楚。

而用MDA的方法来看拷贝数变异,则不是那么容易看清楚。

临床应用

单细胞测序,有着广泛的应用前景。目前最主要2个应用:1个是在胚胎植入前进行基因拷贝数变异检测。第2个,是进行肿瘤的染色体变异研究。

在这里我们介绍一下,单细胞测序在胚胎植入前检测中的应用,在有习惯性流产的夫妇当中,最常见的病因就是染色体的平衡易位,所谓染色体平衡易位,也就是A染色体,的一段移到了B染色体上。

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如果夫妻一方有染色体平衡易位,那么这对夫妇的受精卵中,每4个受精卵,可能只有1个是正常的。剩下3个(不正常的受精卵),很可能会流产。

要把这一个正常的受精卵挑出来,目前,最有效的解决手段是做受精卵植入前检测。

那么具体的操作方法,就是先做人工受精。

在受精卵发育到8个细胞的时侯,通过显微操作,抓一个细胞出来进行测序。

在这个测序过程当中,就要用到MDA方法或MALBAC方法进行扩增、建库、测序。

然后测序完成之后,挑出那个好的受精卵,植回到母亲的子宫中去。长成一个正常的新生儿。

这个,就是受精卵植入前基因检测。

这项技术,是对生殖健康有很大帮助的一项新技术。

  1. 单细胞mRNA测序

今天,想和大家谈一下单细胞mRNA测序技术。

单细胞mRNA测序一直是科学家关注的一个热点。目前市场主要有2种建库方法,分别是Clontech公司推出的SMART法,和EpiCentre公司推出的TargetAmp方法。

要实现单细胞mRNA测序,需要解决2个难题。

第一个难题:PCR偏差

第一个难题就是一个人类细胞当中,它的总RNA量大约只有10pg左右(1pg=10-12g),中的mRNA的量大约只有0.2个pg。要把那么少的mRNA转变成约零点几个μg(1μg=10-6g)以上的核酸文库,这意味着核酸的扩增量要达到几百万倍以上。

如何能在这个核酸扩增过程当中不引入太多的PCR偏差,就一直是个大问题。

所谓PCR偏差,就是在PCR扩增过程当中,某些片段被大量扩增,而大部分片段被扩增的量很少,甚至根本就没有被扩增。结果就导致高通量测序,只能测到这所有样本当中很少一部分的片段序列。

PCR偏差会随着PCR循环的次数的增多而指数放大。那么,在这种情况下,一方面要把核酸扩增几百万倍,甚至更多的倍数;另一方面,又想得到均一覆盖的文库,这就是单细胞mRNA建库当中,所要解决的第一个大难题。

第二个难题:去除核糖体RNA

第二个难题是如何能尽可能高效地得到“mRNA”的文库,而不是含了大量“rRNA”序列的文库。因为rRNA在总RNA当中占了95%,甚至更高的比例,而mRNA在总RNA当中只占2~3%的比例。如果不加区分地进行逆转录,再扩增、建库很可能测序得到的绝大部分序列都是rRNA的序列。

但是 rRNA序列不能给我们带来有效的生物信息,它是无用的。而只有测到mRNA的序列,才是我们想要的信息,这样,如何能够选择性地把mRNA转化成测序文库,并且避免把rRNA带到测序文库中来,这就是单细胞mRNA测序当中,要解决的第二个大难题。

接下来,我们就来介绍SMART方法和TargetAmp方法,是分别如何解决上述2个大难题的。

SMART方法

我们先来介绍Clontech公司推出的SMART方法。

SMART方法的全称是Switching Mechanism at 5’ End of RNA Template。

这张图就是SMART方法的原理图。

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SMART方法最核心的技术,就是设计了2个特殊的引物。再配合用MMLV逆转录酶进行逆转录。

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我们先来看这个逆转录的起始引物。它哪,先是一段通用序列,未来这个通用序列会用作PCR扩增的引物识别序列,中间是一长串的T,这些T是专门识别mRNA的3’末端的Poly(A)尾巴序列。它会和这些Poly(A)尾巴互补结合,引物的最末端有一个定位的结构,这个定位的结构,就是在它的3’末端的倒数第2个碱基是一个非T的简并碱基。

图中用V来表示这个碱基。V碱基就是或A、或C、或G,但是非T的这样一个(简并)碱基。

最后1个碱基则是简并碱基N,也就是A/C/G/T都有可能。

引物的这个末端结构,就是让它正好结合在mRNA的3’端连到Poly(A)尾巴的这个连接处,而不会结合到mRNA的别的地方。这样就保证了逆转录的起始位置正好是mRNA的3’端的序列终止位置。

我们再来看这个MMLV逆转录酶,这个酶有个特点,就是它在转录到mRNA的5’端末端的时侯,会在新合成的cDNA的3’末端,多加出几个C碱基来。

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再接下来,这个上游引物会发挥它的作用。这个上游引物,它有一个特点,它的3’端是3个非脱氧的G碱基,也就是核糖核酸的、RNA的G碱基,而不是DNA的G碱基,这个引物可以与刚才新合成的cDNA的3’端的那几个C碱基发生互补杂交,然后引导这个MMLV酶再次发挥聚合作用,以刚才那条新合成的cDNA为模板,复制的结果,就是得到双链的cDNA。

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这个双链cDNA,两端都已经接好了我们人工设计的PCR引物序列,然后,就加入常规的PCR引物,进行常规的PCR扩增,常规PCR扩增,得到大量DNA。然后可以象常规的DNA建库那样,超声打断、建库、上机测序了。

我们回顾一下这个过程,可以看到这个方法的3个巧妙点。

第1点,是先用一个定位引物,保证cDNA的合成是从mRNA的3’最末端开始的,同时让合成出的cDNA在下游连上了一个通用PCR序列。

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第2点,是利用MMLV逆转录酶会在新合成的cDNA的3'端,多加上几个C碱基的特点,再用有3个G碱基的上游引物进行第二链的合成。这就保证只有完整的第一链cDNA也就是那些带多个“C”的cDNA(第一链)才能被合成出cDNA的第二链,这也就保证了双链cDNA是全长的cDNA。

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第3点,就是要保证PCR扩增的效率的一致性那我们知道,PCR扩增效率的最主要的影响因素是引物的序列,现在因为cDNA的5’端和3’端的都分别引入了统一的引物序,所以,这就去除了因为引物序列的不同。而引起PCR效率不同的,这个最主要的偏差因素。这也就在较大程度上保证了PCR扩增效率的一致性,减少了PCR偏差。

经过实验发现

用SMART方法,对于1个细胞,也就是10pg总RNA的RNA进行建库测序,RPKM为10的这些基因,有60%是被测序测到的;对RPKM为100的基因,有90%可以被测序测到。而且被测到的几率,波动很小。这说明SMART方法是一个有效的单细胞mRNA测序方法。

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TargetAmp方法

接下来,我们介绍第2个单细胞mRNA建库的方法--TargetAmp方法

这个方法是由Illumina公司旗下的EpiCentre公司开发的。

这个就是TargetAmp的原理图。

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首先是用T7-Oligo(dT)的引物进行cDNA合成。这个引物,在5’端有设计了一个T7启动子序列。3’端是多个的T碱基,这一串T碱基可与mRNA的poly(A)尾巴相结合,作为逆转录的起始引物,经过逆转录,得到第一链的cDNA。同时这条cDNA链上,被引入了一个T7启动子。

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然后用RNase H酶把cDNA:RNA双链产物中的这个RNA链消化掉,接着再合成出第二条cDNA链来,这个双链的cDNA就可以作为转录的模板。利用链上的T7启动子,转录出大量的反义RNA来(antisense-RNA,aRNA)。

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接着,将这些反义RNA进行纯化。再用随机引物进行逆转录,得到第二轮的cDNA,接着,再用T7-Oligo(dT)这个引物,粘到第二轮的cDNA的Poly(A)尾巴上,再合成出双链DNA来。

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这个双链的cDNA再经过第二轮的转录,又得到第二轮的反义RNA,这些第二轮的反义RNA的量,足可以达到微克级。再经过一轮逆转录,就可以得到几个微克的cDNA。那么几个微克的cDNA,就足以进行建库、测序之用了。

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我们来看TargetAmp方法的巧妙之处:

它不是用PCR来扩增核酸,而是用转录的方法来增加核酸的量。因为扩增那么多(倍)的核酸,如果用PCR,要用几十个循环,那么PCR不同的扩增子的扩增效率,即使一开始是很小的差异,也会在几十个循环中,被指数放大,变成一个很大的差异。

那么TargetAmp方法用转录的办法,而且统一都用T7这个统一的启动子,它转录的启始效率,大体上就保持了一致。

它的每一轮转录,都把核酸的量扩大几千倍。经过这样两轮的扩增,就把核酸的量扩大了几百万倍。这样,一方面它得到了高达几微克的核酸。足够用于建库,同时又避免了PCR过程,也就避免了PCR扩增偏差

单细胞mRNA测序方法,在循环肿瘤细胞研究、胚胎发育研究、和神经活动研究方面,有着广泛的应用。

随着高通量测序的费用不断地降低,它正变成科研中越来越普及的研究手段。相信有更多单细胞mRNA建库方法,和更新的技术应用会不断地被开发出来

  1. 甲基化测序

本期节目,要给大家介绍一下DNA的甲基化和羟甲基化的高通量测序。

DNA的甲基化是在DNA的序列不变的条件下,在其中某些碱基上加上甲基的这样一个过程。

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DNA甲基化的结果,一般是使甲基化位点的下游的基因表达量变少。

化学反应

这个(甲基化)分析方法当中的核心化学反应,是用亚硫酸氢盐来处理DNA。DNA当中,没有甲基化或羟甲基化的C碱基,就会被转化成U碱基。

我们来看这个转化的过程,在弱酸性条件下,亚硫酸氢根会结合到没有甲基化的C碱基的6位。而甲基化了的C碱基不会和亚硫酸氢根发生这个反应的。

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然后,用碱来处理。结合了亚硫酸氢根的非甲基化的C,就被脱氨基,并且脱亚硫酸根。然后,就被转化成U碱基。

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那么,甲基化或者羟甲基化的C碱基,因为之前没有和亚硫酸氢根起反应,所以现在用碱来处理,它也不会发生脱氨基反应。所以,它还保持了是“C”。

用亚硫酸氢盐来处理DNA,可以让99%左右的非甲基化的C碱基变成U。

也就是说这种方法的的转化效率非常高,转化效率达到了99%。

它的优点,就可以让我们接下来通过高通量测序的方法,可以精确地看到单个碱基的甲基化的水平。

经过亚硫酸氢盐转化过的DNA,再经过PCR,PCR新合成出来的链,U碱基的位置,就会被替换成了“T”。那么在接下来的测序过程中,测到的也是T碱基。

而甲基化的C,因为没有被亚硫酸氢盐所转化,所以,在接下来的测序过程中,被测到的,还是“C”碱基。

这样,通过测序,看一个位置是“C”,还是“T”。如果它保持是“C”,就说明这个位置是被甲基化、或者羟甲基化了。如果测到的是“T”,就说明这个位置是没有被甲基化、或者羟甲基化。

建库方法

接下来,我们谈一下甲基化的建库过程。

先说第一种,用Illumina公司的Truseq DNA建库方法,来做甲基化测序。

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因为Illumina Truseq DNA建库试剂盒当中,它所提供的接头,那么这个接头上的C碱基都是已经经过甲基化修饰了。

所以,用这些接头做出来的文库,在用亚硫酸氢盐做转化的过程当中,它的(接头上的)C还是保持是C ,不会被转成U。

带了这些接头的文库分子,就可以和测序芯片上的草皮DNA发生互补杂交。并且进一步发生桥式PCR反应。生成测序用的DNA的簇(Cluster)。

但是,这个方法有一个缺点,就是在用亚硫酸氢盐处理DNA文库的时侯,90%以上的DNA链会断掉。这样,已经建好的文库,其中90%分子会被破坏掉。也就是说文库的丰富度就会损失90%以上。

那么,相应的它有它的好处,它的好处就是,在这个建库过程当中用的PCR循环数较少。所以它PCR扩增效率不同,所引起的文库不均一程度也就较低。也就是我们通常所说的PCR bias较少。

接下来,再说第二种建库方法。

为了解决文库丰富度受到损失的这个问题,EpiCentre公司开发了EpiGnome方法,方法的操作过程如图。

第1步,亚硫酸氢盐先处理DNA,把未甲基化的C都转变成U。

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第2步,把带标签1的随机引物加入,进行第一次的复制。得到第1条的复制链。

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第3步,是消化掉过量的引物。

第4步,是加入带末端终止碱基、并带标签2的随机引物。这个引物的作用是让第1复制链延伸,并且加上标签2。

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第5步是加入建库的PCR引物,进行PCR。通过PCR,把Index序列和成簇引物序列加入到链的两侧。得到真正的文库。

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这个方法的优点是,把亚硫酸氢盐处理的过程,放在了建库之前。这样建成的库的丰富程度会比较高。但是这个方法也有缺点,缺点就是要做较多的PCR循环,那么有了比较多的PCR循环之后,PCR产物的扩增均一性是不太好的。也就是说PCR bias会比较大。

上述两种方法,各有优缺点。

HiSeq2000/2500****测甲基化文库的问题、和解决方案

在Illumina的HiSeq 2000或者2500平台上进行测序,如果文库是碱基平衡的文库,也就是说,每个特环当中,A/C/G/T四种碱基的比例,各占25%左右的话,测序仪对碱基的判读会比较好。

但是如果缺少了一种或者几种碱基,测序仪对碱基的判读就会出问题。测序得到的数据质量就会下降。并且效的数据产量也会降低。

关于文库碱基平衡度影响数据质量和产量的原因,在【陈巍学基因】第二期的视频,HiSeq义器的工作原理这一集中有介绍。大家可以在优酷当中找一下,并且看一下。

因为甲基化文库中经过亚硫酸氢盐处理,绝大多数的C都变成了T。所以,这个文库中是严重地缺少C碱基的,也就是四种碱基的比例是严重不平衡的。这样在用HiSeq 2000或2500测序仪来测甲基化文库的过程当中,文库测序得到的数据质理就较差。并且经过PF过滤得到的有效的数据产量也会较低。

为了弥补甲基化文库的碱基不平衡性,一般情况下,在上机过程当中,是掺入大比例的基因组文库,或者PhiX文库,来补充比较多的C碱基,一般会掺30%的PhiX文库、或者基因组文库。

在掺入30%的PhiX文库的条件下,一条HiSeq 2000 V3 PE100的Lane,大概可以得到20G 左右的甲基化文库数据。

也就是说,在HiSeq 2000或者2500平台上,甲基化文库的测序数据产量,一直都不是很高。质量也比较低。

羟甲基化测序

接下来,我们说一下区分“羟”甲基化和甲基化的测序方法。

在用单纯的亚硫酸氢盐法来测的过程当中,甲基化和差甲化的C碱基都不能被转化成U碱基,所以单纯的亚硫酸氢盐法是无法区分甲基化或羟甲基化的C碱基的。

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为了区分甲基化和羟甲基化,科学家想出了两种办法。

第一种办法,是通过高钌酸钾(KRuO4)来氧化羟甲基化的C。羟甲基化的C可以被转化成甲酰化的C碱基,而甲酰化的C碱基,是可以被亚硫酸氢盐转化成U的。

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而甲基化的C,不会被转化成U。这样就把原来的羟甲基化的C和甲基化的C给区分开来了。

经研究表明,用高钌酸钾氧化的方法来氧化羟甲基化的C,其转化效率是94%左右。也就是说,每100个羟甲基化的C中,有94个会被高钌酸钾转化成甲酰化的C。并进一步被亚硫酸氢盐转化成U。

同时,原来的甲基货摊C,只有2.1%会被转化成甲酰化的C。

第二钟区分羟甲基化C的方法,是用糖基把羟甲基化的C给保护起来。然后用TET蛋白(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1),把甲基化的C转化成羟基化的C。

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进一步将羟甲基化的C转化成甲酰化的C和羧基化的C。甲酰化的C和羧基化的C都可以被亚硫酸氢盐转化成U。

而之前被糖基化保护起来的羟甲基化的C,是不会被TET蛋白转化成甲酰化的C或者羧基化的C的。在亚硫酸氢盐的处理过程中,它还保持是C。并且在之后的PCR扩增产物中,也表现为C。

这样,就可以把羟甲基化的C,和甲基化的C,给区分开来。

用这个方法,没有甲基化的C,99.6%都被转化成了U。甲基化的C,97.7%都被转化成了U。而羟甲基化的C,只有8%被化成了U。

也就是说92%的羟甲基化的C得到了糖基的保护,还保持了C。

上述,就是目前2个区分羟甲基化的C和甲基化C的方法。

设置内参

在甲基化文库建程当中,亚硫酸氢盐对未甲基化的C的转化效率并不是100%,一般是在99%左右。

为了对实验的转化效率进行质量控制。一般会在转化实验当中加入内参对照品。

一般情况下,是用甲基化酶缺陷型的大肠杆菌,所生产出来的完全没有被甲基化的λ(噬菌体)DNA,或者pUC19(质粒)DNA做内参。来看一次实验当中C的转化效率。

一般情况下,实验当中是加入1%的完全没有甲基化的λ DNA做内参。

同样道理,也可以通过用甲基化酶处理过的,CpG岛完全被甲基化的DNA,来跟踪甲基化DNA对亚硫酸氢盐转化的抵抗效果。

数据分析

最后,我们来谈一下,甲基化测序后的数据处理。

因为亚硫酸氢盐处理过后,绝大部分的C都被转化成了T。这样,测出来的序列在和基因组进行对比的时侯,直接对比是对比不上的。

为了要进行比对,就要把基因组的碱基做两种转变。

第一种转变是把基因组上所有的C都改到T,再来和测序测到的序列来对比。这样,就可以把原来的链给对比上。

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第二种转变,是把基因组上所有的G都变成A,这样才能和经过PCR得到的原样本链睥互补链对比得上。这样做的原因,是原样本链的互被链,它上面绝大部分的G,都被变成了A。所以,只有把(参考)基因组上的G,也都改成A,这样才能对比得上。

比对上之后,再来看哪些碱基是没有被转化的。这样,就可以确认这些碱基的甲基化修饰情况了。

再接下来,针对基因进行GO和Pathway的分析。在【陈巍学基因】第8期视频,RNA-seq当中,对GO和Pathway有详细的介绍,大家可以在优酷或者腾讯视频当中搜一下,看一下。

补充材料

DNA的甲基化分析,还有很多种方法,有兴趣的同学,可以在微信公众号【陈巍学基因】当中,回复“甲基”两个字,就可以看到7种其它分析DNA甲基化的方法。

7.Moleculo长测序

今天,会和大家谈一谈“Moleculo”测序方法。

Moleculo原来是美国的一家创业公司。这家公司开发了一种拼接长测序序列的方法。这个方法一经面世,就引起了Illumina的重视,Illumina马上出巨资,收购了这家公司。

在收购了Moleculo之后,Illumina把这个方法进行了优化。优化之后,以“TruSeq Synthetic

Long-Read DNA Library Kit”的形式,出现在Illumina的新产品当中。

在全新的基因组组装工作中,也就是我们通常所说的“De Novo”工作中,最核心的技术点,是能否得到大量的、长读长的序列。所以,得到长的读长序列,一直是做De novo工作的科学家所追求的有效技术手段。

另外,长读长的序列还可以帮助科学家来确定染色体单体的基因型。

Illumina标准的HiSeq/MiSeq测序方法,提供了一次给出大量序列的方法。它的序列,精度也很高,每个G的数据的测序成本也很低,但是,相对于De novo工作来说,它的读长还是不够长。

举例来说,Illumina旗下测序长度最长的MiSeq测序仪它的测序长度是:双端各300个碱基。那么,我们把这双端的300个碱基拼起来,中间交错100个碱基,可以得到一个500碱基的读长,

那么,我们要用500碱基读长的序列来组装一个和人类基因组大小相近的一个基因组,也就是单倍体长度为30亿个碱基长度的基因组,就相当于用筷子那么长(25厘米)的铁轨,来拼出一个京沪铁路(1300公里)。大家稍微想一想,就可以想出其中的难度。

Moleculo方法,它的巧妙点就是可以把Illumina不算太长的序列,拼接成一个一个10KB读长的序列,然后,再拼出基因组来。

接下来,我们就来介绍一下这个巧妙的办法。

第一步,分拆

首先是把长片段的基因组DNA,也就是40KB以上的长片段的基因组DNA,打断成10KB左右的DNA片段。

这个打断的过程,是用Covaris公司出品的g-TUBE方法来打断的。g-TUBE可以把长的基因组DNA,打断成5KB-20KB长度的片段。

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打断了的DNA片段,末端大多数不是平齐的。接下来,就要用酶把这个末端给补平。

补平的过程,是用T4 DNA聚合酶、和Klenow聚合酶,两者的混合酶来进行补平。然后,再用T4 DNA寡核苷酸激酶,在5'端统一地加上磷酸基团。

补平之后,再用去掉了3'端外切酶活性的Klenow大片段聚合酶来进行处理。

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这样,可以在每个片段的两个3'端,都各加上一个A碱基。加好了A碱基之后再用连接酶,在DNA片段的两端连上第一步的PCR接头。

连好接头的DNA片段,走琼脂糖凝胶,切胶回收10KB左右的DNA片段。

回收下来的DNA片段,用qPCR进行精确定量。

第二步,扩增

用qPCR精确定量好之后的DNA片段,做成一个长PCR的Master Mix。

然后,把这个Master Mix分散到384孔PCR板里面,进行长PCR。

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那么这里有一个注意点:就是如果是用来做De novo的文库,那么稀释到384孔的每一个小孔里,是3个fg(1 fg = 1 * 10^-15 g)的DNA。而如果是做染色体(单体)基因分型的,则是稀释到每个小孔75个fg的DNA。

之所以做De novo的这个PCR,要用更稀的模板,是因为,不希望一个小孔里面的片段,相互之间有交叠。

接下来,做长PCR在做长PCR的时侯,如果是用来做De novo的是做21个循环,而如果是做染色体基因分型的,则是做15个循环。

这个区别,是因为之前的两种反应,所加的起始模板量是不一样的。那么,现在要在PCR的环节当中,通过循环数的不一样,把DNA的最终产量,给拉平。

第三步,Nextera建库、测序

接下来,就用Nextera方法,对扩增好的片段,进行打断,并加上末端标签。

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Nextera打断的原理,是用结合了DNA标签的转座酶,和之前扩增得到的10KB的DNA片段进行反应。

转座酶,一方面,会把长片段给切断成短的小片段。

另一方面,它也会把酶本身结合了的DNA标签,连在切出来的小片段DNA的末端上。

这个新加上的DNA标签,就成了接下来PCR扩增的引物结合序列。

再接下来,就是加入有P5、P7测序引物序列,同时带有Index序列的PCR引物,进行新的一轮PCR扩增。

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那么这一轮PCR扩增的结果,就会把Index序列,和P5、P7测序引物序列都加到扩增出来的DNA片段上。

这一轮的扩增完成之后,我们就得到的,就是384个带了完整的接头序列、Index序列的文库。

再接下来,就把这384个文库混合在一起,用柱子进行回收。

然后,就可以用Illumina测序仪进行测序了。

第四步,组装

测序完成之后,通过Index序列,把384个文库的序列可以分开,然后,分别进行组装。

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组装的结果,就是得到了许多个10KB的组装序列。

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然后,可以用这10KB的组装序列,再去拼染色体的序列。

上面所说,就是Moleculo的合成长序列的测序方法。

要点总结

它的核心技术,就是把一个完整的基因组DNA,分成了384个小份。每一份中,又含了若干个10KB的DNA片段,而这一个小孔的中DNA片段,相互交叠的可能性很小。

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所以,在重新组装的时侯,先组装成一个、一个10KB大小的片段。然后,再从10KB的片段,组装成染色体的序列。

这个,要比直接从几百个BP的序列,组装成染色体,要容易许多。

总的来说,Moleculo方法,就是把一个大难题,分解成2个相对容易解决的小问题,再进行分步地解决。最后,得到一个我们想要的结果。

以上是本期节目的全部内容,谢谢您的收看,我们下期节目再见。

8. Ribozero和方向性RNA文库

今天,会和大家谈一下RNA建库当中的RiboZero处理还有建方向性的RNA文库。

那么,我们先来说用RiboZero的方法,来处理总RNA之所以要用RiboZero方法来处理RNA。是因为在总RNA当中,大部分是核糖体RNA。而且这个比例高达95%左右而核糖体RNA在一个物种当中是高度保守的。所以,测核糖体RNA,一般情况下是没有什么研究意义的。

科学家测RNA,一般是想得到mRNA、还有Long non-coding RNA的变化信息。包括它的表达量变化,和结构上的变异信息。

所以,在RNA建库过程当中,很重要的一步就是要去除核糖体RNA。那么,要去除核糖体RNA最常用的方法,就是用带poly(T)探针的磁珠来和总RNA进行杂交。

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这样Poly(T)探针和mRNA上的Poly(A)尾巴结合。然后,用磁珠来回收这些吸附在探针上的、带poly(A)尾巴的mRNA,把mRNA洗脱下来之后,就可以进行下面的建库。

但是这个方法有一个缺点,就是它对总RNA质量的要求非常高。一般会要求总RNA的RIN值在8.0以上。如果总RNA有一定程度的降解,那么Poly(T)探针所能吸附到的,都是靠近mRNA的3’端的那些片段而mRNA的5’端的那些断片,就会大部分地被丢失。所以,测序得到的结果就会有很大的偏向性。

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另外,如果是要测的是长链非编码RNA,也就是Longnon-coding RNA,也称作LncRNA,也是不能用Poly(T)方法来做的。因为大部分的LncRNA,它是没有Poly(A)尾巴的,所以它就不能用Poly(T)的探针来吸附。

RiboZero

为了解决上述的问题,Illumina公司旗下的EpiCentre公司开发了RiboZero方法,来去除核糖体RNA。这个方法的原理不是通过探针来吸附带有Poly(A)尾巴的RNA序列。

而是倒过来,设计吸附核糖体RNA的探针,用探针来吸附核糖体RNA。再用带链霉亲合素的磁珠来吸附这些带生物素标记的探针。

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最后磁珠被磁铁吸附在管壁上。

而其它的RNA,包括mRNA、LncRNA、和small RNA等RNA则留在上清液当中。

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实验这样设计,就得到了2个结果。

第一点,就是对RNA样本的质量要求不再是很高。部分降解的RNA、或者降解程度很严重的RNA都可以用RiboZero的方法去除核糖体RNA。

最典型的是从石蜡样本归中回收的RNA样本,因为从石蜡样本中回收的RNA样本,它的质量是非常差的,之前是很难用来做测序的。现在有了RiboZero方法,就可以很方便地制备出文库来、并且进行测序。

第二点,就是那些不带Poly(A)尾巴的LncRNA,现在也可以被测序测到了。所以,现在市场上,大部分的LncRNA建库,都是通过RiboZero的方法,去除核糖体,接下来再进行建库。

但是RiboZero方法,它也有一个限制,就是每个物种的核糖体RNA的序列,它是有所不同的。

所以每种RiboZero的试剂盒,它其中的探针序列,都是有物种特异性的。EpiCentre公司开发了多个针对不同物种的RiboZero Kit。其中最常用的是针对:人、小鼠、大鼠的这个试剂盒。所以,科研客户在请测序公司进行RiboZero方法的建库、测序的时候,需要和测序公司确认所测的物种信息。

接下来,我们要介绍一下建定向的RNA库的方法。

目前最常用的Truseq RNA建库方法,它是在双链cDNA的两端,对称地加上了两个Y型的接头,然后变成文库。

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这个方法,它有一个缺点,就是它加接头的方向是对称的。所以测完序后,我们无法知道测出来的序列的方向性。也就是说,无法知道测到的是RNA的正义链,还是反义链。

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如果我们测的是人、小鼠之类的样本,那么问题不是很大。因为这些模式生物基因组序列,转录本序列,都是比较清楚的。

但是,如果我们是在测一些新的物种的时候,那么我们就不知道测到的是正义链,还是反义链了。

为了解决这个问题,科学家设计了多种方向性文库的建库方法。今天,我们就为大家介绍其中两种方向性的文库的建库方法。

掺U法

我们先来看这第一种方法。这种方法的原理,它是用掺入U碱基的办法,来标识cDNA的第二条链。

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我们具体来看一下这个方法。

首先,它用常规的方法,从RNA上逆转录出第一链的cDNA。

然后,合成第二链时,所用的dNTP,它是特殊的。它用dUTP来代替了dTTP,用这样的dNTP来合成出的第二链,它当中就掺入了大量的U碱基。

而之前的第一链,是没有U碱基的。这样,第一链和第二链就有了差别。

接下来,在双链cDNA的两端接上Y型的接头。然后,用USER酶(Uracil-Specific Excision Reagent)进行消化。

那我们这里介绍一下USER酶。USER酶,它是一个混合酶。其中的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)能够识别DNA链中的U碱基,并且把U碱基进行糖基化。接着,这个糖基化的U碱基从核酸链上切掉。这样核酸链上就型成了一个缺碱基的一个空位。接着,混合酶当中的核酸内切酶VIII就在脱碱基位点上把核酸链给切断掉。

刚才我们说了,在合成第二链的时候,是掺入了大量的U碱基那么这个双链的第二链就会被USER酶切得粉碎。也就是说cDNA的第二链被降解掉了。

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降解发生之后,双链的文库就只剩下了一条链。而这条链的两头是接的不同序列的接头。

接下来进行PCR扩增。扩增出来的文库,保持了模板上的双个不对称的接头序列。

那么接下来,我们在测序的时候,测到就是有方向的文库了。

ScriptSeq法

接下来,我们介绍第二种建方向性文库的方法。

这个方法是Illumina公司的ScriptSeq方法。它的核心原理,是在加接头的时侯,左右两侧就加不同的接头。首先,它在合成第一链的cDNA的时候,它用的右侧引物,就是带了标签“A”

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的接头。从这个接头延伸出来的cDNA链,很自然地在其右侧就连上了A接头序列。

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接下来,把一个特殊的TTO引物(Termianl TaggingOligo )加进去。这个TTO引物的5’端是左侧的标签序列“B”。3’端是一连串随机序列,这些随机序列的作用是与刚才合成出来的第一链(cDNA)进行杂交。

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但是这个随机序列的3’端的最后一个碱基是一个双脱氧核苷酸,它的作用是不让这个TTO引物发生延伸反应。这个TTO引物与刚才合成的第一链cDNA杂交之后,第一链cDNA就在聚合酶的作用下,进一步延伸。延伸的结果就是把左侧的标签“B”也加到cDNA链上。

接下来,再用外侧的PCR引物对进行扩增,这对外侧的引物即带有一段与标签互补的序列。又带一段有与测序芯片上的接头互补的序列。这样扩增得到的产物,就是正式的文库了。

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因为这个文库的左右是带了不同的标签的,所以这个文库,它测出来就是有方向性的。这样我们就得到了方向性的文库。

以上是本期视频的全部内容。

谢谢您的收看,我们下期节目再见。

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