Evolutionary conservation analysis of human arachidonic acid metabolism pathway genes
1. Levels of sEH and Eicosanoid Metabolites Altered in Myocarditis
作者首先使用了靶向LC-MS/MS检测了心肌炎患者样本中 eicosanoids（包括环氧酶 COX, 脂氧酶 LOX 和 CYP 通路的代谢物的变化，也就是上图）结果显示EET是变化最显著的(a)，出现了显著下降(b)。而DHET/EET ratio则显著上调，提示sEH的活性上调(c)。在心肌炎小鼠样本中也得到了一致的结果（d-f）。在心肌炎患者心脏样本中，sEH蛋白表达显著升高(g)。在心肌炎小鼠样本中也是一样，造模后3天小鼠心脏中sEH水平即升高，并主要是在心肌和成纤维中表达(h-k)。
2. sEH Inhibition Prevents Cardiac Dysfunction of CVB3-Induced Myocarditis by Promoting an Antiviral Response
为了确定EETs是否可以阻断心肌炎的进展，作者使用sEH抑制剂TPPU对心肌炎小鼠进行了治疗。结果显示心肌炎小鼠心功能改善，心脏炎症浸润程度减轻，巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞浸润减少。心脏促炎因子的表达下降，而干扰素的表达上升，心脏病毒含量也下降。Implying that the increased production of IFNs in sEH inhibitor–treated mice prevented viral replication.
为了更好的模拟临床情况，作者在给予CVB3后第3天开始给予TPPU，持续到4w。结果也显示了很好的治疗效果。
3. 14,15-EET Positively Regulates Type I IFN Production
随后，作者使用CVB3干预了原代心肌细胞和成纤维细胞。结果显示干预12h后，sEH蛋白表达在两种细胞中都显著上调。而sEH抑制剂减轻了CVB3干预后的病毒复制。在EET中，最显著改变的是14,15-EET，而14,15-EET 的 antagonist 14,15-epoxyeicosa- 5(Z)-enoic acid (EEZE; 1 μM) 抵消了TPPU的保护作用。
此外，和体内实验结果一致，CVB3可以诱导I型和II型干扰素的表达，而抑制 sEH 则以EEZE-sensitive manner增加了IFN-α 和 IFN-β的表达。其中IFN-β的变化更为显著。IFN-β调节蛋白ISG15 和 CXCL10的表达也同样sensitive to sEH inhibition and 14,15-EET。同样的， sEH inhibition 和14,15-EET 的功能 were sensitive to the EET antagonist。
阻断IFNAR则消除了sEH inhibition 和 14,15-EET的保护作用。Thus, the antiviral actions linked to sEH inhibition seem to be linked to 14,15-EET–dependent effects on IFN expres- sion and IFNAR activation.
4. EETs Enhanced Type I IFN Signaling After CVB3 Infection by Targeting TBK1
由于IRF3在病毒感染时诱导I型干扰素表达中发挥着重要作用，因此作者探究了14,15EET和IRF3活化间的潜在关系。结果显示，CVB3感染的AC16细胞引起IRF3 Ser396位点的磷酸化，IRF3dimer形成增加和核转位增加(a-d)。14,15EET（以及11,12EET）干预AC16也得到了一致的结果。
CVB3激活IRF3的主要途径包括e图中的两条（下图的左部分，漏掉了cGAS）。
Nucleic Acid Sensors as Therapeutic Targets for Human Disease
si掉MDA5显著下调了CVB3和EET诱导IRF3磷酸化的能力(f)，而si掉TLR3则没有得到类似的效果(g)。随后作者进行了荧光报告基因实验。显示过表达MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D都可以增强荧光素酶IFNB活性，而且EETs可以在过表达MDA5, MAVS, 和 TBK1的细胞中显著增强荧光素酶活性，但是在过表达 IRF3- 5D mutant中则没有(h)。另一方面，reduced IRF3 phosphorylation in response to CVB3 and abrogated the effects of the sEH inhibitor and EETs(I)。 Overall, these findings suggest that EETs are able to promote type I IFN signaling by targeting TBK1.
5. EETs Positively Regulated TBK1 Activation via Enhancing the Interaction Between GSK3β and TBK1
接着，作者探究了14,15-EET 和 11,12-EET 是怎样增加TBK1的活化并调控 type I IFN 通路的。使用CVB3感染、TPPU干预、EET干预都不影响TBBK1的表达，EET干预后的AC16也不存在TBK1磷酸化增加，提示存在着其他调控机制。随后，作者使用了IP-MS检测了与TBK1结合的蛋白。结合磷酸化质谱数据，鉴定出GSK3β与TBK1相互作用，并且在11,12-EET and 14,15-EET刺激后的AC16中其磷酸化增加。
si掉GSK3b后，CVB3和EET诱导的IRF3活化减低(a)。而且CVB3诱导的IRF3 磷酸化并没有受到影响，提示EETs 的功能依赖于这个激酶的表达。而且CVB3干预后AC16的GSK3b磷酸化增加，EET刺激后，其磷酸化也增加(b)。此外，14,15-EET 在CVB3感染后增强了GSK3β 和 TBK1 的互作(c)。因此，作者通过replacing Tyr216 with aspartate (Y216D) or phenylalanine (Y216F)构建了GSK3β的 nonphosphorylatable 和 phosphomimetic 突变体，结果显示在病毒感染后的细胞中，Y216D mutant 诱导了了的TBK1磷酸化(d)。Con- sistent with these observations, 14,15-EET increased TBK1 phosphorylation in CVB3-infected cells express- ing the wild-type GSK3β but not in cells expressing the nonphosphorylatable GSK3β mutant(e, f)。
Thus, in the course of CVB3 infection, EETs are able to positively regulate TBK1 activity by eliciting the phos- phorylation of GSK3β to enhance its interaction with
TBK1.
随后，作者构建了心肌细胞特异性sEH敲除的小鼠。结果显示敲除鼠给予CVB3后其心功能改善，心脏炎症减轻，TBK1和GCSK3B表达和磷酸化均增加。
最后，作者探究了是否抑制GSK3β可以影响EET的保护作用(a)，结果显示给予了AAV9-U6-shGSK3B的小鼠显著降低了心脏GSK3β的表达(b)，并阻断了EET的保护效应(c,d)。给予GSK3β抑制剂也得到了一致的结果(e-g)。同时 GSK3β 抑制剂降低了sEHiΔMyh6心肌细胞中TBK1 和 GSK3β 的磷酸化。Collectively, these data indicate that EETs exert a cardioprotective effect during CVB3 infection through a GSK3β-dependent signaling cascade involving the type I IFN pathway.
