脓毒症导致新生儿死亡的高风险被认为是先天性免疫细胞反应受损的结果；然而，临床观察到的新生儿脓毒症高炎症状态与这一概念相矛盾。作者使用转录组、表观遗传学和免疫学方法证明大量的围产期警戒素 S100A8 和 S100A9 会特异性地改变 MyD88 依赖性促炎基因程序。S100 programming可以阻断高炎症反应，而不会损害对病原体的防御。依赖于TRIF-adaptor 的调控基因不受围产期S100 programming 的影响，并对脂多糖反应强烈，但几乎不表达。TRIF依赖基因的稳态表达在人类新生儿出生后的第一年才逐渐增加，使免疫调节转向成人表型。瞬时alarmin编程的这一关键序列的中断以及随后调控通路的重编程增加了过度炎症和脓毒症的风险。这些数据共同表明，新生儿具有选择性、暂时微生物无反应性的特点，可防止脆弱新生儿出现有害的过度炎症，同时提供足够的免疫保护。
1. Reciprocal TLR4 signaling in adult and neonatal monocytes
Fig 1a： 为了捕捉新生儿和成人之间的总体差异，作者评估了分离了成人和脐带血单核细胞，评估了这些细胞在 LPS 诱导下的全局转录调控。作者确定了差异表达基因，绘制了共表达基因网络。在网络中，受调控最强烈的基因的分布在成人和新生儿之间存在很大差异。根据GO注释对 LPS 诱导的基因进行聚类表明，TLR4 下游的主要信号模块参与程度不同。与 MyD88 依赖性信号转导相关的基因在成人单核细胞中富集，而 TRIF 依赖性和 JAK-STAT 信号转导级联的基因在新生儿单核细胞中的比例过高。
Fig 1b： 通路富集分析验证了作者的观察结果，即 LPS 的基因上调在成人单核细胞中主要通过 MyD88 依赖性信号传导，而在新生单核细胞中主要通过 TRIF 依赖性信号传导。
Fig 1c： qPCR结果也显示成年单核细胞与新生单核细胞相比，在 LPS 刺激下 MyD88 依赖性候选基因（CCL2、IL6、IL1B、CXCL2、CCL20 和 TNF）的上调率明显更高。相比之下，新生单核细胞诱导的 TRIF 依赖性调控基因（IFNB1、IDO1、CCL5、CXCL10、CXCL11 和 CD80）明显高于成年单核细胞。总之，这些发现证实了在 TLR4 下游，成人和新生儿单核细胞中定义信号模块的相互使用。
TLR信号转导通路分为MyD88依赖通（激活NFKB和MAPK）和MyD88非依赖通路（激活IFN通路）
Toll 样受体 (TLRs) 可识别不同的病原体相关分子模式，并在先天性免疫应答中扮演着不可或缺的角色。它们是抵御病原体入侵的第一道防线，在炎症、免疫细胞调控、存活和增殖方面发挥着关键作用。到目前为止，已发现11个 TLR 家族成员，其中 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR11 位于细胞表面，而 TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9 位于内体/溶酶体部分。
TLR 信号转导通路的激活来源于细胞浆 Toll/IL-1 受体 (TIR) 的结构域，该结构域与 TIR 结构域包含的接头蛋白 MyD88 发生相互作用。经过配体的刺激，通过两个分子死亡结构域的相互作用，MyD88 将 IL-1 受体相关激酶-4 (IRAK-4) 吸引到 TLRs。IRAK-1 经磷酸化而激活并与 TRAF6 发生作用，从而激活 IKK 复合体并导致 MAP 激酶 (JNK, p38 MAPK) 和 NF-κB 的激活。Tollip 和 IRAK-M 均与 IRAK-1 相互作用，并负性调节 TLR 介导的信号转导通路。调节这些通路的其他模式包括通过 RIP1 并依赖 TRIF 来诱导的 TRAF6 信号转导，以及通过 ST2L、TRIAD3A 和 SOCS1 负性调控 TIRAP 介导的下游信号转导。(
MyD88依赖通路)
MyD88 非依赖通路通过 TRIF 和 TRAF3 激活，导致 IKKε/TBK1 的募集，IRF3 磷酸化以及 β 干扰素的表达。TIR 结构域含有接头蛋白如 TIRAP、TRIF 和 TRAM，此结构域可为单个 TLR 信号转导级联提供特异性，从而调控 TLR 介导的信号转导通路。TRAF3 通过自身降解，对依赖于 MyD88 和依赖于 TRIF 的信号转导调节具有非常重要的作用，分别可激活依赖于 MyD88 的信号转导和抑制依赖于 TRIF 的信号转导 (反之亦然)。多数TLR的激活依赖于MyD88通路，少数依赖于TRIF途径，如TLR3。TLR4则可以同时启动MyD88和TRIF途径。
2. Baseline differences define the inverse LPS responsiveness
Fig 2a-b： 为了更好地了解成年单核细胞和新生单核细胞中的相互信号转导，作者接下来进行了PCA分析，并对所有数据中方差最大的 1000 个基因进行了分层聚类。
Fig 2c： 成人和新生儿单核细胞基线的 DE 基因数量最多。
Fig 2d： 基线 DE 基因的基因GO分析和分层聚类表明，在新生儿单核细胞中，基线表达升高的基因具有促炎症免疫反应功能，而与免疫调节相关的基因与成人单核细胞相比表达较低。
Fig 2e： qPCR 实验也证实了新生儿单核细胞中依赖 MyD88 的促炎基因基线表达升高，而依赖 TRIF 的调节基因与它们在成年单核细胞中的表达相比几乎没有表达。因此，相对于 LPS 诱导性，这些基因程序的基线表达模式是倒置的（图1c）。
Fig 2f： 当作者使用无偏方法分析 LPS 诱导基因的共表达网络时，这种反向关系依然存在。在新生儿单核细胞中，63 个共表达基因的基线表达水平高于成人单核细胞，但它们在 LPS 刺激后的表达增加较少，这导致 LPS 诱导水平的表达差异较小。相比之下，57 个在新生儿单核细胞中稳态表达较低的基因在 LPS 诱导的表达中出现了较高的倍数变化，达到了与成人单核细胞相似的 LPS 诱导表达水平。流式细胞术分析证实，成人单核细胞比新生儿单核细胞受 LPS 诱导的 IL-6 和 TNF 的产生依赖于 MyD88，而新生儿单核细胞未受刺激时 IL-6 和 TNF 的过夜累积量高于成人细胞，这反映了较高的基础产生量。相反，依赖 TRIF 的 CCL5 和 CD80 蛋白表达在成人单核细胞中基线显著较高，在 LPS 刺激后几乎没有变化，而在新生儿单核细胞中，我们观察到了相反的模式：CCL5 和 CD80 的基线表达较低，而在 LPS 刺激后表达显著增加。这些数据共同表明，LPS 反应基因的基础表达是确定成人和新生儿单核细胞对 LPS 激活反应性的关键变量。
（Fig 1比的是新生儿和成年细胞LPS刺激前后的差异，Fig2主要关注的是新生儿和成年细胞之间的差异）
3. Postnatal signaling via MyD88 is specifically altered
依赖 MyD88 和依赖 TRIF 的 TLR4 信号模块中 LPS 反应基因表达的反向模式促使作者评估各自adaptor分子的表达。
Fig 3a： 成人和新生儿单核细胞中的 MYD88、MAL、TICAM1 和 TRAM1 mRNA 基线均未出现在差异基因中DE。因此，adaptor（也就是衔接蛋白）的不同表达并不是新生单核细胞与成年单核细胞中 MyD88 和 TRIF 依赖性基因对 LPS 反应性不同的原因。
参与信号转导的分子包括：蛋白激酶、衔接蛋白和转录因子。作者看了衔接蛋白没有差异，就转而去比较细胞因子的差异。
Fig 3b：因此，作者探索了 TLR4 信号级联下游相关转录激活因子的激活情况。以两组共表达的基础 DE 基因（图 2f）为bait，作者进行了overrepresentation analyses，结果显示 IRF3 转录因子结合位点（TFBSs）和 STAT1 TFBSs 在 57 个低表达基因中强富集，而新生儿单核细胞中表达升高的 63 个基因主要是 NF-κB 靶点。第二种unbiased approach to TFBS overrepresentation 使用了对 PCA 的第一和第二主成分有贡献的前 2.5%的基因，得到了类似的结果。
Fig 3c： LPS 诱导的成年单核细胞和新生单核细胞转录组转变同样显示出 NF-κB TFBS 的显著富集，而成年单核细胞和新生单核细胞之间的基本转变则表现为新生单核细胞转录组中 IFR5 TFBS 的富集和 STAT1 TFBS 的代表性不足。这些数据表明，新生儿单核细胞中的 NF-κB 和 IRF5 活性较高，而 IRF3 和 STAT1 活性较低。
Fig 3d： 随后作者在蛋白质水平上检测了 TLR4 下游转录激活因子的激活情况，发现成人而非新生儿单核细胞在 LPS 处理后 NF-κB p65 被迅速磷酸化。
Fig 3e： 相反，作者在新生单核细胞而非成年单核细胞中观察到了 RelB 的显著核积累。
Fig 3f： 在新生儿单核细胞中，IRF5 的先验表达和二聚化与刺激无关，而在成人单核细胞中，IRF5 的表达只有在 LPS 激活后才会增加，但没有二聚化。这些数据表明，新生单核细胞中依赖于 MyD88 的信号激活发生了改变，NF-κB 难以激活，IRF5 的基础活性较高。
Fig 3g, h： 然而，IRF3 和 STAT1 在成人和新生儿单核细胞中的表达和磷酸化程度相似，因此不能解释新生儿单核细胞中 TRIF 依赖性基因的低基础表达。
4. S100 alarmins program MyD88-dependent genes in newborns
Fig 4a： 以前曾有报道称，新生单核细胞会释放大量的警报素 S100A8 和 S100A9，这些内源性 TLR4 配体会诱导类似 ET10 的急性低反应状态，但成人单核细胞不会。在健康的新生儿中，血清中 S100A8/A9 的含量在出生后 5 天内极高（高达 20,000 纳克/毫升），然后迅速下降，最终在出生后第二周达到正常成人值（220 ± 40 纳克/毫升）。作者研究了这些 alarmins 是否参与了新生儿单核细胞 LPS 反应基因的不同编程。当作者从脐带血中分离新生儿单核细胞并对其进行培养时，作者观察到 IL6、IL1B 和 TNF 的预激活状态随着时间的推移而消失；在 2 μg/ml S100A8/A9 的存在下，这些依赖于 MyD88 的基因的表达量持续较高，这与健康足月新生儿在出生后 5 天内血清中 S100A8/A9 的平均含量相符。相比之下，S100A8/A9 对新生儿单核细胞中依赖 TRIF 的 IDO1、CCL5 和 CXCL10 的低表达没有明显影响。
Fig 4b： 此外，S100A8/A9 诱导的转录因子激活模式与对基因转录的影响一致。在 S100A8/A9 处理的成人单核细胞中，NF-κB p65 和 IRF5 被强烈激活，但 IRF3 没有被激活。STAT1 也被激活，但其快速动力学表明其激活途径与 IRF3 无关。这些数据表明，S100A8/A9 通过 NF-κB 和 IRF5 激活诱导 MyD88 依赖性基因程序，对出生时的新生单核细胞进行特异性编程，而不影响 TRIF 依赖性基因。
Fig 4c, d： 为了探索不同细胞程序的表观遗传调控，作者研究了启动子相关的组蛋白修饰，重点是与基因抑制相关的组蛋白 H3 在 Lys9 上的三甲基化（H3K9me3），以及与基因激活相关的组蛋白 H4 在 Lys91 上的 H3K4me3 和乙酰化（H4K91ac）。在成人单核细胞中，LPS 刺激后，MyD88 依赖性基因 IL6、IL1B 和 TNF 的 H4K91ac 明显增加。在新生单核细胞中，这些基因的启动子具有较高水平的 H3K4me3 和 H4K91ac 基线，但在 LPS 刺激后没有观察到进一步的组蛋白乙酰化或去乙酰化。这些结果与警报素介导的新生单核细胞中 IL6、IL1B 和 TNF 基因表达的预激活和 LPS 低反应性一致，而在成年单核细胞中这些基因表达具有很强的诱导性。相反，在成人单核细胞中，IDO1、CXCL10 和 CD80 的启动子区域有明显的 H3K4me3 和 H4K91ac 标记。这些标记在 LPS 刺激后没有变化，这就解释了这些基因在成人单核细胞中具有稳固的基础表达调性和适度的 LPS 诱导性。在新生单核细胞中，所有这些 TRIF 依赖性基因的启动子都没有乙酰化，而且在基线时几乎没有三甲基化，但在 LPS 刺激后却出现了强烈的乙酰化，这与出生时缺乏基础基因表达但 LPS 诱导性很强是一致的。在没有 S100 alarmins 的情况下，依赖 MyD88 的基因失去了预激活状态（4a），Fig 4e： 这在表观遗传学水平上也得到了再现。在培养基中培养分离的新生单核细胞，随着时间的推移，IL1B 和 TNF 启动子中的 H3K4me3 和 H4K91ac 水平不断下降。
Fig 4f： 在用 S100A8 预处理 4 小时的成体单核细胞中，去除 S100A8 后，H4K91ac 信号显示出相似的动力学，而 H3K4me3 的衰减主要出现在 TNF 启动子上。
总之，新生单核细胞和 S100A8 刺激的成年单核细胞去除 S100A8 后，随着时间的推移，IL1B 和 TNF 启动子上的活化组蛋白标记减少。这些数据进一步说明，新生单核细胞的功能并没有受损，而是在转录和表观遗传学上都进行了不同的编程。
5. Postnatal reprogramming of TRIF-dependent gene programs
Fig 5a： 成人和新生儿单核细胞之间的差异表明，细胞重编程是出生后成熟的结果。作者尝试在体外模拟这种重编程，将新生儿和成人单核细胞暴露于成人血浆中 14 天。两组细胞的存活率和巨噬细胞样形态的获得相似。
Fig 5b-c： 培养 14 天后，新生单核细胞中 MyD88 依赖性基因的表达量下降到与成人单核细胞相似甚至更低的水平（b），这导致 LPS 的诱导作用明显增强（c）。与此相反，新生单核细胞中大多数依赖 TRIF 的基因的表达在培养 14 d 期间没有增加（b），而且这些基因在培养后仍对 LPS 刺激有较强的诱导反应（c）。这些数据表明，由于缺乏平行成熟的调控通路，alarmin 程序的缺失导致新生单核细胞出现炎症表型。
Fig 5d： 作者假设依赖 TRIF 的调控基因需要在体内条件下才能达到成人的基线水平，因此作者评估了健康婴儿出生后第一年与成人之间单核细胞中基因表达的变化。与作者在体外模型中观察到的情况类似，出生后立即高表达的促炎性 IL6 和 IL1B 在出生后的头几天迅速减少。然而，依赖 TRIF 的调控基因在出生后 11-30 天（CD80）和出生后 6-12 个月（CCL5 和 IDO1）达到了成人表达水平。CXCL10 的表达在出生后第一年内未达到成人水平。
总之，这些数据清楚地证实了一种模式，即炎症基因在出生时被瞬时预激活，从而被耐受转录编程，随后在出生后第一年内重新编程调控通路，使其趋向成人表型。
6. S100 alarmins prevent fatal experimental neonatal sepsis
作者接下来研究了在小鼠新生单核细胞与成年单核细胞中是否也能发现MyD88和TRIF依赖基因的编程和LPS反应性的反向模式。在基线时，小鼠新生单核细胞中依赖 MyD88 的促炎基因 Il1b 和 Tnf 的表达量明显较高，而依赖 TRIF 的基因 Ido1、Ccl5 和 Cd80 的表达量则明显较低，但这些基因在体外 LPS 刺激后和体内内毒素血症时都具有反向诱导性。为了研究出生时alarmin的释放是否会影响新生儿的高炎症和脓毒症，作者在野生型小鼠和S100a9-/-小鼠中使用了新生儿金黄色葡萄球菌感染模型。
Fig 6a： S100a9-/-小鼠无法形成S100A8/A9异质复合物，因此因代谢周转率升高而缺乏S100A8。感染金黄色葡萄球菌后，S100a9-/-新生儿无一存活，而野生型新生儿的存活率为 90%。
Fig 6b： S100a9-/-新生儿的促炎细胞因子，如 IL-6、TNF、CCL2 和 CCL7 的产生量明显升高（和补充图 5a）。
Fig 6c： 这些细胞因子在感染后 12 小时就已可检测到，当时细菌负荷仍然较低，与野生型新生儿相同，在受到热灭活金黄色葡萄球菌挑战时也可检测到。与野生型新生儿相比，S100a9-/-新生儿的这种快速高炎症过程导致了致命的脓毒症，感染 24 小时后主要器官的细菌负荷更高，这可能是高炎症初始阶段造成的二次损伤的结果。
Fig 6d, e： 在细胞水平上，野生型与 S100a9-/- 小鼠单核细胞和多形核中性粒细胞（PMNs）的遗传背景对细胞吞噬和杀死金黄色葡萄球菌的能力没有影响。
Fig 6f： 与未经处理的对照组小鼠相比，用 S100A8/A9 或更强效的 S100A8 单独处理 S100a9-/- 新生儿，可显著提高其感染金黄色葡萄球菌后的存活率。
Fig 6g-h： 与此同时，新生儿对金黄色葡萄球菌的炎症反应也明显减弱，细菌清除率也有所提高。重组 S100A8 并不直接刺激野生型或 S100a9-/- 小鼠吞噬细胞的抗菌功能（d、e）。
这些数据进一步支持了这样一个概念，即与出生相关的alarmins编程对预防高炎症至关重要。
7. Low S100 levels at birth are linked to higher sepsis risk
接下来，作者研究了 S100 alarmins、病原体防御过程中的免疫反应和人类新生儿脓毒症风险之间的相关性。在细胞水平上，与成人单核细胞相比，人类新生儿单核细胞在感染金黄色葡萄球菌后的炎症反应较弱，而我们能够通过用 S100A8/A9 或 S100A8 预处理成人单核细胞来模拟这种反应。与未处理的成人单核细胞相比，新生儿和 S100A8/A9 预处理的成人单核细胞能更有效地杀死细菌。所有单核细胞的存活率和吞噬率相似。
最后，脐带血中 S100A8/A9 的水平高于健康成人的血清水平，但早产儿队列中的 S100A8/A9 水平明显低于健康足月儿（a），这表明出生时 S100A8 和 S100A9 的释放与脓毒症风险之间存在负相关。此外，在早产儿组中，出生后第 9±5 天出现经血液培养证实的晚发性新生儿脓毒症（LONS）的婴儿出生时的 S100A8/A9 水平明显低于未出现晚发性脓毒症的婴儿（b）。脐带血中 S100A8/A9 的含量大于 2,000 纳克/毫升与低于 330 纳克/毫升相比，患 LONS 的风险降低了 25 倍，这表明脐带血中 S100A8/A9 的含量是一种潜在的生物标志物，S100A8/A9 含量低表明依赖 MyD88 的炎症基因程序设计不足，从而导致新生儿脓毒症风险升高。这些发现共同反映了 S100A8 和 S100A9 对新生儿炎症反应性的有益调节功能，而不会损害新生儿的抗菌能力。
