在这一段历史中，人们的生命随时都有可能骤然熄灭，伊莎贝拉对此都有体验。阿方索也被各种推测指向了中毒而亡，数千年中的艰难时代，毒药常常在王位继承中发挥重要作用。在伊莎贝拉时代，人民在谈到用毒药杀人时常常提及“草药”——毒芹、屋头、洋地黄和蒿。编年史家们推测阿方索就是被他们所说的草药毒死的。
但是也有一种观察，阿方索的死不符合当时现有的任何一种毒药，疾病在当时确实也是无处不在的威胁。14世纪50年代的黑死病冲中国通过丝绸之路来到欧洲，据说杀死了欧洲人口的四分之一。
将人毒死的好处是成功毒杀可以模仿自然疾病，这样就较难发现真实死因。胡安二世的第一任妻子和葡萄牙往后这对阿拉贡姐妹在相继几天内死去，据说被毒死。
中世纪晚期向文艺复兴过渡的阶段，大约就是在伊莎贝拉长大成人的时期，毒药的流行程度大大提升。威尼斯和罗马在当时都出现了传授毒药技术的学校。在意大利半岛，下毒害人的现象司空见惯，以至于出现了一个新词“被意大利”，意思就是被毒死。
阿方索的死使得伊莎贝拉成了王位继承人，这倒使得她陷入了不利境地，最终通过宣布弟弟病逝，并宣布效忠恩里克四世得以和解，顺利的拿到了王位继承人。1468年9月19日两人在吉桑的田野会面以下是一些原文描写：在这风声萧瑟的原野，伊莎贝拉起这一头骡子赶来，象征性地展示自己的谦逊态度。大教主徒步陪伴她，在随后的典礼上，她被正式指定为王储。她也宣誓尽在得到恩里克四世批准的情况下才会结婚。恩里克把承诺给伊的城镇和阿斯图里亚斯亲王领地都给了她。
此时胡安娜由于和恩里克四世分居时剩下了教主的孩子，进一步丧失了名誉。由于随后胡安娜的作怪又使得恩里克四世食言，准备再次把伊莎贝拉嫁到国外，胡安娜使更多的人相信小胡安娜才是国王的亲生女儿，因为恩里克也确实爱这个孩子，所以对剥夺她的继承权感到耻辱而出尔反尔。随后伊迎来了很多追求者，恩里克四世四世认真考虑了其中的四位：英格兰爱德华四世的弟弟、法兰西王室幼支贝里公爵（法兰西国王路易十一的弟弟）、剩下的两位都来自伊比利亚半岛，都是她的亲戚——葡萄牙国王阿方索五世，还有一位也是她最喜爱的人，费迪南，童年时代就相信会成为自己真命天子的人。虽然也被恩里克拒绝，但是即将十八岁的伊莎贝拉已经开始秘密与费迪南谈婚论嫁。
