重点：
• Probiotic BB-46 modified the gut microbiota differently from BB-46 combined with pectin.
•Citric pectin combined with BB-46 increased intestinal butyric acid production.
•Citric pectin combined with BB-46 decreased intestinal ammonium ions production.
· 益生菌 BB-46对肠道菌群的修饰不同于 BB-46对果胶的修饰。
· 柠檬酸果胶联合 BB-46增加肠道丁酸产量。
· 柠檬酸果胶联合 BB-46降低肠道铵离子的产生。
主要结论：
肠道微生物群组成及其代谢产物对人体健康有重要影响。
利用益生元和益生菌调节肠道微生物群可以带来很好的结果。
本研究旨在利用人体肠道微生态系统模拟器(SHIME)评价益生菌长双歧杆菌 BB-46单独和与柠檬柠檬酸果胶联合使用对健康成人肠道菌群的影响。
Additionally, the combination of B. longum BB-46 and pectin reduced the abundance of proteolytic bacteria Bacteroides, Clostridium, Peptoniphilus, and Streptococcus, along with decreased NH4+ production.
采用16S rRNA 基因序列测定、短链脂肪酸(SCFAs)和铵离子(NH4 +)分析等方法，评价微生物区系组成和代谢活性的变化。在结肠各区域，单独使用长杆菌 BB-46处理可使厚壁菌(特别是莲座螺科和乳杆菌科的成员)和拟杆菌的相对丰度增加。用长杆菌 BB-46和果胶处理能够增加粪便杆菌属、真杆菌属和 Lactobacillus 属以及反刍动物科横结肠和下降结肠的比例。同时，这两个分室的丁酸水平均有所上升。此外，结合 b. longum B.-46和果胶降低了蛋白水解菌 Bacteroides，梭状芽孢杆菌，胃蛋白酶和链球菌的丰度，同时降低了 NH4 + 的产量。
肠道微生物的作用：
促进免疫系统的稳定，
将食物转化为有用的营养物质，
并防止病原微生物的入侵(Ehrlich，2010; Lozupone 等人，2012)。
微生物组成与疾病：
然而，由居住地、环境影响、生活方式、抗生素使用和饮食等因素引起的微生物群组成的变化已经与几种疾病联系起来。
由于饮食被认为是影响肠道微生物群组成以及人类健康的一个重要因素(ramakkrishna，2013) ，人们对改善人类肠道微生物生态系统的食物策略越来越感兴趣。在不同的策略中，益生菌和其他纤维的使用，以及益生菌和前益生菌的组合已经被强调.
益生菌的作用：
益生菌能够改善免疫系统，上皮屏障功能和产生抗菌因子 。
双歧杆菌的作用：
益生长双歧杆菌菌株的一些积极作用，如抗过敏作用(Dev 等人，2008年) ，刺激肠道免疫系统细菌(Makioka，Tsukahara，Ijichi，& Inoue，2018年) ，改善肠道环境和排便频率(Yaeshima 等人，1997年)已经在动物和人类干预研究中得到证实。
果胶作为膳食纤维，起的作用：
果胶是存在于水果和蔬菜细胞壁中的重要水溶性膳食纤维。他们已经被定义为新兴的益生元，证明有能力调节肠道微生物群，增加双歧杆菌分裂和丁酸产生菌，例如粪便杆菌。
果胶素可以增加益生菌的存活，减缓胃的运输和降低血糖指数.
果胶的分类：
果胶分为高甲基化果胶(HM)和低甲基化果胶(LM) ，甲基酯化度 > 50% ，DM < 50% 。
研究的原因：
健康人类肠道微生物群的变化是由长双歧杆菌和柠檬酸果胶的结合引起的，这种变化还没有被描述过。因此，这项研究的目的是评估益生菌 BB-46和从柠檬中提取的 LM 果胶结合使用 SHIME 模型对肠道微生物群调节的影响长双歧杆菌。
**人体肠道微生物生态系统模拟器：The Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME®)
SHIME (注册商标来自根特大学和 ProDigest)是一个人体肠道微生物生态系统的模拟器，其中环境条件(pH，停留时间和温度)是由一个软件控制的(Molly 等人，1994)。它由五条双层血管组成，分别模拟胃、十二指肠和升结肠、横结肠和降结肠。5个容器被连续地用磁力搅拌器搅拌，温度保持在37 ° c。该系统通过每日 N2冲洗30分钟的厌氧维持。通过添加 NaOH 1 m 或 HCl 0.1 m (Molly et al. ，1994; Possemiers，verthé，Uyttendaele，& Verstraete，2004) ，pH 值上升(pH 值在5.6至5.9之间)、横向(pH 值在6.1至6.9之间)和降结肠(pH 值在6.6至6.9之间)的自动调节。结肠的每个隔间都填充了前面描述的特定体积的 SHIME 饲料(基于碳水化合物的培养基，允许微生物根据 pH 值范围、保留时间和可用碳源的特定环境条件适应结肠)(Bianchi 等人，2014年; Molly 等人，1994年)。胃的条件以及胰液的使用和制备(由 Oxgall 6.0 g/L，nahco312.5 g/L 和胰酶0.9 g/L 组成)是基于 Bianchi 等人(2014年)和 Bianchi，Lopes 等人(2018年)的研究。
***利用16S rRNA 基因序列分析微生物区系组成
应用标签编码的16S rRNA 基因测序 NextSeq (美国圣地亚哥 Illumina 公司) ，测定了 SHIME 模型结肠血管三个时期(对照、处理和处理后)的微生物区系。
***代谢产物: 短链脂肪酸和铵离子：在对照、 T1、 T2处理及处理后每隔一周(上行、横行、下行)采样50ml，进行 SCFAs 和 NH4 + 分析。
短链脂肪酸：SCFAs用气相色谱测定。
铵盐测定：NH4 + 水平由选择性离子仪(HI 4101模型，Hanna 仪器，英国莱顿巴扎德)和铵离子选择性电极(Orion 95-12)测定。
统计分析：
使用 Biostat 5.0软件(IBM，贝伦，BR)(Ayres，Ayres，Ayres，& Santos，2007) ，采用单因素方差分析和 Tukey 事后检验(p < . 05)检验结果(微生物群组成，SCFAs 和 NH4 + 的产生)之间的显著差异。使用 Minitab 软件(美国州立大学)(Minitab，2010)对不同处理与微生物群组成的相关性进行了简单的对应分析。采用开源软件 RStudio (RStudio，2017)进行 Spearman 相关性检验(p < 0.05) ，确定了短链脂肪酸、 NH4 + 产量与特定细菌属之间的相关性。
微生物组成：
图1显示 SHIME 模型不同区域的主要细菌家族的相对丰度: 升结肠血管(V3)、横结肠血管(V4)和降结肠血管(V5)。对照期间发现双歧杆菌科(V3 = 35% ，V4 = 38% ，V5 = 32%)和卷杆菌科(V3 = 14% ，V4 = 7% ，V5 = 5%)均属于放线菌门，以及勃艮第科(V3 = 10% ，V4 = 17% ，V5 = 17%)和肠杆菌科(V3 = 17% ，V4 = 11% ，V5 = 10%)均属于变形杆菌门。
在使用 b. gum B.-46(T1)处理过程中，所有的结肠血管中细菌科(门类杆菌)、肠道细菌科(门类杆菌)、乳酸杆菌科(门类杆菌)和乳酸杆菌科(门类杆菌)的数量都增加了，而且双歧杆菌科的数量也减少了。在 V3中使用 b. longum B.-46和果胶(T2)处理时，观察到乳杆菌科的相对丰度增加(从0.28% 增加到37.51%)和肠道细菌(从16% 增加到33%) ，而反刍动物科的高增加(从3% 增加到73% ，从10% 增加到43%) ，在同一实验期间观察到细菌和肠道细菌科的减少(T2)。一周后的处理(PT)显示了类似的结果处理 T2在 V3和 V5，表明在 T2期间获得的修饰保持(图1)。
A simple correspondence analysis was performed to investigate the association between the treatments and the microbiota composition ([Fig. 2](https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996918308950?via%3Dihub#f0010)). The correspondence analysis was sufficient to interpret the results as seen from the explained variance (Component 1 = 36.3% and Component 2 = 29.8%). The control period of ascending (V3), transverse (V4) and descending (V5) colons were clustered according to the high abundance of *Bifidobacteriaceae*, *Burkholderiaceae, Streptococcaceae, Erysipelotrichaceae* and *Coreobacteriaceae* families. The high proportion of *Lachnospiraceae*, *Bacteroidaceae* and *Clostridiaceae* families found after treatment T1 accounted for the clustering of samples during this treatment. Grouping of the treatment T2 and PT from V3 was due to the high abundance of *Enterobacteriaceae*and *Lactobacillaceae* families. The *Ruminococcaceae*, *Rikenellaceae* and *Eubacteriaceae*families were associated with treatment T2 and PT from V4 and V5.
T1和 T2处理后各细菌类群丰度的变化与对照差异显著(p < 0.05)。用 b. longum B.-46(t 1)处理，刺激了乳酸杆菌属和 Dorea (无梗螺菌科)、 Bacteroides、肠杆菌属以及无分类的无梗螺菌科的一个属的增殖，并减少了所有三种结肠血管中的链球菌。真杆菌属在 T1期也受到刺激，但只在 V5期受到刺激。B. longum BB-46联合果胶(T2)处理显著增加了 v 3中的乳杆菌属、 Veilonella 属、肠杆菌属、克雷伯菌属和 Erwinia 属，显著增加了 v 4和 v 5中的粪便杆菌属、真杆菌属和未分类的反刍动物科属。此外，在 v 4和 v 5的 t 2处理过程中发现肠杆菌、克雷伯氏菌和 Erwinia，以及 Bacteroides、胃蛋白酶和链球菌的缺失，而在 v 5的 t 2处理过程中发现乳酸杆菌属的缺失。
图3。在 SHIME 结肠血管处理过程中，细菌属的相对丰度的数据聚类发生了显著变化。与对照组相比显著增加(p < . 05)表现为“●” ，与对照组相比显著减少(p < . 05)表现为“○”(单因子方差分析和 Tukey 事后检验)。C = 控制时间; T1 = 处理长双歧杆菌 BB-46; T2 = 处理 BB-46和果胶; PT = 处理后处理。3 = 升结肠; 4 = 横结肠; 5 = 降结肠。未分类的属用“ g _”表示。
Levels of acetic and butyric acids had a significant decrease (*p* < .05) during the treatments with *B. longum* BB-46 (T1) and *B. longum* BB-46 with pectin (T2) in the ascending colon, whereas no visible changes were noted for propionic acid ([Fig. 4](https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996918308950?via%3Dihub#f0020)). On the other hand, a significant increase (*p* < .05) in butyric acid was observed during the treatment T2 in the transverse and descending colons. There were no significant visible changes of propionic and acetic acids in the transverse and descending colons during treatments T1 and T2, except for a reduction of acetic acid in the transverse colon during treatment T1.
在所有结肠血管治疗 T2期间，与其他研究期间相比，可以观察到 NH4 + 生成的显著减少(表1)。显然，T1处理对 NH4 + 的产生没有影响。治疗前后小肠组织中 NH4 + 水平明显高于治疗组(p < 0.05) ，但低于对照组(p < 0.05) ，表明治疗组有一定的残留效应(表1)。
处理过程中代谢产物的产生与细菌种类的关系:
我们评估了细菌属、 SCFAs 和 NH4 + 的相对丰度之间的相关性，以确定可能有助于 SCFA 和 NH4 + 产生的属(图5)。真杆菌属、 Dorea 属和粪便杆菌属与丁酸水平呈正相关(r-value = 0.60-0.80，p < . 05) ，而反刍动物科一个未分类属与醋酸产量(r-value = 0.66)和丁酸产量(r-value = 0.95)呈正相关(p < . 05)。克雷伯菌属、肠杆菌属、 Erwinea 属和一个未分类的肠道细菌属的相对丰度与醋酸、丙酸和丁酸呈负相关(r-value =-0.52ー-0.95，p < . 05)。链球菌、 Bacteroides 菌、梭状芽胞杆菌和胃肠道菌数量与 NH4 + 产量呈正相关(r 值在0.60 ~ 0.73之间，p < 0.05)。
The increase in butyric acid during treatment T2 can also be attributed, at least to a certain extent, to the cross-feeding interactions between the probiotic strain B. longum BB-46 and other bacteria, such as Faecalibacterium and Eubacterium, stimulated by the presence of pectin. This assumption is based on previous studies showing that the formation of butyrate by Faecalibacterium prausnitzii is enhanced in the presence of bifidobacteria, demonstrating the cross-feeding between Bifidobacterium and F. prausnitzii (Ríos-Covián et al., 2016). Moreover, Moens et al. (2017) demonstrated that some bacterial strains, such as Eubacterium, are able to consume lactate generated by other bacteria, such as Bifidobacterium spp., converting the lactate into butyric acid.
T2处理过程中丁酸含量的增加，至少在一定程度上可归因于益生菌 b. longum B.-46与其它细菌(如粪便杆菌和真杆菌)在果胶的刺激下发生交叉摄食的相互作用。这个假设是基于以前的研究，这些研究表明，在双歧杆菌存在的情况下，粪便杆菌能够促进丁酸的生成，证明了双歧杆菌和普拉斯尼茨菌之间的交叉饲养。
结论：
This study provided novel insights on the synbiotic potential of Bifidobacterium longum BB-46 with lemon pectin (T2) to modulate the gut microbiota. We observed that each treatment had a different effect on gut microbiota. Treatment with B. longum BB-46 alone (T1) mainly stimulated members of Lachnospiraceae and Bacteroidaceae families, whereas the combination of B. longum BB-46 with pectin stimulated specific bacterial groups able to degrade pectin and to increase the production of butyric acid. Using the intestinal model SHIME®, this study indicated that the combination (T2) could positively modulate the composition and metabolic activity of the gut microbiota. Although in this study we could deduce that the increase of butyric acid as well as of specific bacterial genera, such as Faecalibacterium, occurred partly due to an interaction between the probiotic B. longum BB-46 and the pectin, new studies using the B. longum BB-46 and pectin alone as well as different types of pectins are welcome to confirm the beneficial effects of B. longum BB-46 combined or not with citric pectins on human health.
