刘小泽写于19.1.20-21

要进行GO或者KEGG富集分析，就需要知道每个基因对应什么样的GO/KEGG分类，OrgDb就是存储不同数据库基因ID之间对应关系，以及基因与GO等注释的对应关系的 R 软件包

如果自己研究的物种不在http://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___OrgDb 之列，很大可能就需要自己构建OrgDb，然后用clusterProfiler分析

所以本次的内容都是基于非模式生物

分类

非模式生物要想找到自己的注释包，又分成两类：

• 一类是在AnnotationHub（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/AnnotationHub.html）中存在的，例如棉铃虫
• 另一类是在AnnotationHub也不存在相应物种，就需要用AnnotationForge（ https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/AnnotationForge.html ）来自己构建

第一类：利用AnnotationHub得到org.db

下面我以棉铃虫为例

首先下载并加载AnnotationHub

options("repos"= c(CRAN="https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/"))
options(BioC_mirror="http://mirrors.ustc.edu.cn/bioc/")

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("AnnotationHub", version = "3.8")
library(AnnotationHub)

然后加载现有的物种database

hub <- AnnotationHub() #这一步受限于网速，不成功的话多试几次
# 调用图形界面查看物种
display(hub) 
# 或者根据物种拉丁文名称查找
query(hub,"helicoverpa")
#   'object[["AH66950"]]' 

            title                                      
  AH66950 | org.Helicoverpa_armigera.eg.sqlite         
  AH66951 | org.Heliothis_(Helicoverpa)_armigera.eg....
# 这里AH66950是我们需要的
# 然后下载这个sqlite数据库
ha.db <- hub[['AH66950']]
#查看前几个基因（Entrez命名）
head(keys(ha.db))
#查看包含的基因数
length(keys(ha.db)) 
#查看包含多少种ID
columns(ha.db)
#查看前几个基因的ID
select(ha.db, keys(ha.db)[1:3], 
       c("REFSEQ", "SYMBOL"), #想获取的ID
       "ENTREZID")
#得到结果
  ENTREZID         REFSEQ SYMBOL
1  9977712 YP_004021052.1   COX1
2  9977713 YP_004021053.1   COX2
3  9977714 YP_004021054.1   ATP8
#保存到文件
saveDb(ha.db, "Harms-AH66950.sqlite")
#之后再使用直接加载进来
harms.db <- loadDb("Harms-AH66950.sqlite")

annotation_hub图形界面

参考：https://mp.weixin.qq.com/s/lHKZtzpN2k9uPN7e6HjH3w

第二类：利用AnnotationForge得到org.db

通过上次的推送（功能注释整合流程），我们知道了怎样利用eggnog-mapper去人工构建注释、富集桥梁

上次选取的是一个病毒的小例子，这次可以用芝麻（Sesame）做演示

先下载蛋白序列

wget http://www.sesame-bioinfo.org/SesameFG/BLAST_search/G608_contig_2014-08-29.FgeneSH.pep.rar
# 解压后上传

因为统计了下有38406条序列，因此使用diamond来进行功能注释

# 前提是自己安装好eggnog-mapper并且下载好相应的数据库
emapper.py -m diamond \
           -i sesame.fa \
           -o diamond \
           --cpu 19
# 得到如下信息，然后进行处理，只保留表头query_name这一行的注释信息，去掉头尾的# 等信息
sed -i '/^# /d' diamond.emapper.annotations 
sed -i 's/#//' diamond.emapper.annotations 

sesame-diamond

关于结果解释：https://github.com/jhcepas/eggnog-mapper/wiki/Results-Interpretation

其中关于COG的介绍：倒数第二列

COG functional categories: COG functional category inferred from best matching OG 【会给出一个大写字母，每一个大写字母都有自己的解释：COG_explanation】

STEP1：自己构建的话，首先需要读入文件

egg_f <- "diamond.emapper.annotations"
egg <- read.csv(egg_f, sep = "\t")
egg[egg==""]<-NA #这个代码来自花花的指导(将空行变成NA，方便下面的去除)

STEP2: 从文件中挑出基因query_name与eggnog注释信息

gene_info <- egg %>%
        dplyr::select(GID = query_name, GENENAME = `eggNOG annot`) %>% na.omit()

STEP3-1：挑出query_name与GO注释信息

gterms <- egg %>%
        dplyr::select(query_name, GO_terms) %>% na.omit()

STEP3-2：我们想得到query_name与GO号的对应信息

# 先构建一个空的数据框(弄好大体的架构，表示其中要有GID =》query_name，GO =》GO号， EVIDENCE =》默认IDA)
# 关于IEA：就是一个标准，除了这个标准以外还有许多。IEA就是表示我们的注释是自动注释，无需人工检查http://wiki.geneontology.org/index.php/Inferred_from_Electronic_Annotation_(IEA)
# 两种情况下需要用IEA：1. manually constructed mappings between external classification systems and GO terms； 2.automatic transfer of annotation to orthologous gene products.
gene2go <- data.frame(GID = character(),
                         GO = character(),
                         EVIDENCE = character())

# 然后向其中填充：注意到有的query_name对应多个GO，因此我们以GO号为标准，每一行只能有一个GO号，但query_name和Evidence可以重复
for (row in 1:nrow(gterms)) {
        gene_terms <- str_split(gterms[row,"GO_terms"], ",", simplify = FALSE)[[1]]  
        gene_id <- gterms[row, "query_name"][[1]]
        tmp <- data_frame(GID = rep(gene_id, length(gene_terms)),
                              GO = gene_terms,
                              EVIDENCE = rep("IEA", length(gene_terms)))
        gene2go <- rbind(gene2go, tmp)
    }  

STEP4-1: 挑出query_name与KEGG注释信息

gene2ko <- egg %>%
        dplyr::select(GID = query_name, Ko = KEGG_KOs) %>%
        na.omit()

STEP4-2: 得到pathway2name, ko2pathway

这一步不需要管代码什么意思，只需要知道它可以帮我们得到以上两个文件就好

options(stringsAsFactors = F)
if(F){
    # 需要下载 json文件(这是是经常更新的)
    # https://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?ko00001
    # 代码来自：http://www.genek.tv/course/225/task/4861/show
    library(jsonlite)
    library(purrr)
    library(RCurl)
    
    update_kegg <- function(json = "ko00001.json") {
        pathway2name <- tibble(Pathway = character(), Name = character())
        ko2pathway <- tibble(Ko = character(), Pathway = character())
        
        kegg <- fromJSON(json)
        
        for (a in seq_along(kegg[["children"]][["children"]])) {
            A <- kegg[["children"]][["name"]][[a]]
            
            for (b in seq_along(kegg[["children"]][["children"]][[a]][["children"]])) {
                B <- kegg[["children"]][["children"]][[a]][["name"]][[b]] 
                
                for (c in seq_along(kegg[["children"]][["children"]][[a]][["children"]][[b]][["children"]])) {
                    pathway_info <- kegg[["children"]][["children"]][[a]][["children"]][[b]][["name"]][[c]]
                    
                    pathway_id <- str_match(pathway_info, "ko[0-9]{5}")[1]
                    pathway_name <- str_replace(pathway_info, " \\[PATH:ko[0-9]{5}\\]", "") %>% str_replace("[0-9]{5} ", "")
                    pathway2name <- rbind(pathway2name, tibble(Pathway = pathway_id, Name = pathway_name))
                    
                    kos_info <- kegg[["children"]][["children"]][[a]][["children"]][[b]][["children"]][[c]][["name"]]
                    
                    kos <- str_match(kos_info, "K[0-9]*")[,1]
                    
                    ko2pathway <- rbind(ko2pathway, tibble(Ko = kos, Pathway = rep(pathway_id, length(kos))))
                }
            }
        }
        
        save(pathway2name, ko2pathway, file = "kegg_info.RData")
    }
    
    update_kegg(json = "ko00001.json")
    
}

STEP5: 利用GO将gene与pathway联系起来，然后挑出query_name与pathway注释信息

load(file = "kegg_info.RData")
gene2pathway <- gene2ko %>% left_join(ko2pathway, by = "KO") %>% 
        dplyr::select(GID, Pathway) %>%
        na.omit()

STEP6： 制作自己的Orgdb

# 查询物种的Taxonomy，例如要查sesame
# https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=sesame
tax_id = "4182"
genus = "Sesamum" 
species = "indicum"

makeOrgPackage(gene_info=gene_info,
                   go=gene2go,
                   ko=gene2ko,
                   pathway=gene2pathway,
                   version="0.0.1",
                   outputDir = ".",
                   tax_id=tax_id,
                   genus=genus,
                   species=species,
                   goTable="go")
sesame.orgdb <- str_c("org.", str_to_upper(str_sub(genus, 1, 1)) , species, ".eg.db", sep = "")

有了Orgdb就可以做富集分析了

# enrichGO最主要的目的就是将基因编号转换成GO号
ego <- enrichGO(gene = id.fc$ENTREZID,
                #模式物种
                #OrgDb = org.Mm.eg.db,
                #非模式物种，例如芝麻
                OrgDb = sesame.orgdb,
                ont = "BP", #或MF或CC
                pAdjustMethod = "BH",
                #pvalueCutoff  = 0.01,
                qvalueCutoff  = 0.01) 
# 同理也能做enrichKEGG

剩下的可以参考：http://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/clusterProfiler/inst/doc/clusterProfiler.html#supported-organisms

添加于2019.4.8，鉴于很多小伙伴都在问如何使用自建数据库进行KEGG分析

########################################
# KEGG
########################################
if(F){
  library(purrr)
  library(tidyverse)
  library(clusterProfiler)
  
########################################################################################
  
  ################################################
  # 导入自己构建的 OrgDb
  ################################################
  library(org.Harmigera.eg.db)
  columns(org.Harmigera.eg.db)
  
  ########################################################################################
  # 导入需要进行富集分析的基因列表，并转换为向量
  #########################################################################################
  
  gene_list <- DEGs[,1]
    
    ################################################
  # 从 OrgDB 提取 Pathway 和基因的对应关系
  ################################################
  
  pathway2gene <- AnnotationDbi::select(org.Harmigera.eg.db, 
                                        keys = keys(org.Harmigera.eg.db), 
                                        columns = c("Pathway","Ko")) %>%
    na.omit() %>%
    dplyr::select(Pathway, GID)
  
  ################################################
  # 导入 Pathway 与名称对应关系
  ################################################
  load("kegg_info.RData")
  
   #KEGG pathway 富集
  ekp <- enricher(gene_list, 
                  TERM2GENE = pathway2gene, 
                  TERM2NAME = pathway2name, 
                  pvalueCutoff = 1, 
                  qvalueCutoff = 1,
                  pAdjustMethod = "BH",
                  minGSSize = 1)
  
  ekp_results <- as.data.frame(ekp)
  
  barplot(ekp, showCategory=20,color="pvalue",
          font.size=10)
  dotplot(ekp)
  
  emapplot(ekp)
  
  
  
}

最后，如果不想构建orgdb还想做富集分析

满足需求永远是第一生产力，如果你只想用一次，那么clusterProfiler的enricher可以学习一下

主要的两个参数需要注意：gene 是基因ID，TERM2GENE 是GO/KEGG terms与基因ID的对应，例如上面图片中的GO_terms、KEGG_KOs等eggnog-mapper结果，提取出来就好。对于没有对应terms的基因ID，那我们就把它们去掉。

参考：http://guangchuangyu.github.io/2015/05/use-clusterprofiler-as-an-universal-enrichment-analysis-tool/

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