这篇文章更多的是对于混乱的中文资源的梳理，并补充了一些没有提到的重要参数，希望大家不会踩坑。
1. 简介
1.1 背景
WGCNA（weighted gene co-expression network analysis，权重基因共表达网络分析）是一种分析多个样本基因表达模式的分析方法，可将表达模式相似的基因进行聚类，并分析模块与特定性状或表型之间的关联关系，因此在基因组研究中被广泛应用。
相比于只关注差异表达的基因，WGCNA利用数千或近万个变化最大的基因或全部基因的信息识别感兴趣的基因集，并与表型进行显著性关联分析。既充分利用了信息，也把数千个基因与表型的关联转换为数个基因集与表型的关联，免去了多重假设检验校正的问题。
WGCNA算法首先假定基因网络服从无尺度分布(scale free network)，并定义基因共表达相关矩阵、基因网络形成的邻接函数，然后计算不同节点的相异系数，并据此构建分层聚类树(hierarchical clustering tree)，该聚类树的不同分支代表不同的基因模块(module)，模块内基因共表达程度高，而分属不同模块的基因共表达程度低。
1.2 无尺度网络
网络的数学名称是图，在图论中对于每一个节点有一个重要概念，即：度(degree)。一个点的度是指图中该点所关联的边数。如下图，如果不加以思考，人们很容易认为生活中常见的网络会是一种random network，即每一个节点的度相对平均。然而第二种图，即scale-free network才是一种更稳定的选择。Scale-free network具有这样的特点，即存在少数节点具有明显高于一般点的度，这些点被称为hub。由少数hub与其它节点关联，最终构成整个网络。这样的网络的节点度数与具有该度数的节点个数间服从power distribution。生物体选择scale-free network而不是random network尤其进化上的原因，对于scale-free network，少数关键基因执行主要功能，这种网络具有非常好的鲁棒性(Robust)，即只要保证hub的完整性，整个生命体的基本活动在一定刺激影响下将不会受到太大影响，而random network若受到外界刺激，其受到的伤害程度将直接与刺激强度成正比。
1.3 相关术语
共表达网络：点代表基因，边代表基因表达相关性。加权是指对相关性值进行冥次运算 (冥次的值也就是软阈值 (power, pickSoftThreshold这个函数所做的就是确定合适的power))。无向网络(unsigned network)的边属性计算方式为
abs(cor(genex, geney)) ^ power；有向网络(signed network)的边属性计算方式为(1+cor(genex, geney)/2) ^ power; sign hybrid的边属性计算方式为cor(genex, geney)^power if cor>0 else 0， sign hybrid意味着它既包含加权网络也包含非加权网络。这种处理方式强化了强相关，弱化了弱相关或负相关，使得相关性数值更符合无标度网络特征，更具有生物意义。除了软阈值还有硬阈值一说，计算方式是 a_ij = 1 if s_ij > β otherwise a_ij = 0。这里的β就是硬阈值(hard threshold)。Module(模块)：高度內连的基因集。在无向网络中，模块内是高度相关的基因。在有向网络中，模块内是高度正相关的基因。
Connectivity (连接度)：类似于网络中 “度” (degree)的概念。每个基因的连接度是与其相连的基因的
边属性之和。Module eigengene E: 给定模型的第一主成分，代表整个模型的基因表达谱。即用一个向量代替了一个矩阵，方便后期计算。
Intramodular connectivity: 给定基因与给定模型内其他基因的关联度，判断基因所属关系。
Adjacency matrix (邻接矩阵)：基因和基因之间的加权相关性值构成的矩阵。
TOM (Topological overlap matrix)：把邻接矩阵转换为拓扑重叠矩阵，以降低噪音和假相关，获得的新距离矩阵，这个信息可拿来构建网络或绘制TOM图。
2. 一般步骤
3. 代码
利用WGCNA有一步法建网络的，也有step by step的方法，为了保证理解，建议至少过一遍step by step。
安装WGCNA根据不同的操作系统可能略有不同，我在macOS下安装着实废了一番功夫。这一部分不提。
# 加载必须的包并做参数设置
library(MASS)
library(class)
library(cluster)
library(impute)
library(Hmisc)
library(WGCNA)
options(stringsAsFactors = F)
读取基因表达数据，注意要做一个转换，保证基因在列，样品在行，官方推荐使用Deseq2的varianceStabilizingTransformation或log2(x+1)对标准化后的数据做个转换。如果数据来自不同的批次，需要先移除批次效应。如果数据存在系统偏移，需要做下quantile normalization。一般要求样本数多于15个。样本数多于20时效果更好，样本越多，结果越稳定。
dat0 <- read.csv("./01raw_data/GBM55and65and8000.csv")
datExprdataOne <- t(dat0[,15:69])
datExprdataTwo <- t(dat0[, 70:134])
datSummary <- dat0[, c(1:14)]
dim(datExprdataOne); dim(datExprdataTwo); dim(datSummary)
rm(dat0)
#[1] 55 8000
#[1] 65 8000
#[1] 8000 14
检验数据质量
gsg = goodSamplesGenes(datExprdataOne, verbose = 3)
if (!gsg$allOK){
# Optionally, print the gene and sample names that were removed:
if (sum(!gsg$goodGenes)>0)
printFlush(paste("Removing genes:",
paste(names(datExprdataOne)[!gsg$goodGenes], collapse = ",")));
if (sum(!gsg$goodSamples)>0)
printFlush(paste("Removing samples:",
paste(rownames(datExprdataOne)[!gsg$goodSamples], collapse = ",")));
# Remove the offending genes and samples from the data:
datExprdataOne = datExprdataOne[gsg$goodSamples, gsg$goodGenes]
}
#Flagging genes and samples with too many missing values...
# ..step 1
检查是否有离群值，结果显示无
sampleTree = hclust(dist(datExprdataOne), method = "average")
plot(sampleTree, main = "Sample clustering to detect outliers", sub="", xlab="")
筛选软阈值， 无向网络在power小于15或有向网络power小于30内，没有一个power值可以使无标度网络图谱结构R^2达到0.8或平均连接度降到100以下，则可能是由于部分样品与其他样品差别太大造成的。这可能由批次效应、样品异质性或实验条件对表达影响太大等造成，需要移除。
powers1 <- c(seq(1, 10, by=1), seq(12, 20, by=2))
sft <- pickSoftThreshold(datExprdataOne, powerVector = powers1)
RpowerTable <- pickSoftThreshold(datExprdataOne, powerVector = powers1)[[2]]
cex1 = 0.7
par(mfrow = c(1,2))
plot(RpowerTable[,1], -sign(RpowerTable[,3])*RpowerTable[,2], xlab = "soft threshold (power)", ylab = "scale free topology model fit, signes R^2", type = "n")
text(RpowerTable[,1], -sign(RpowerTable[,3])*RpowerTable[,2], labels = powers1, cex = cex1, col = "red")
abline(h = 0.95, col = "red")
plot(RpowerTable[,1], RpowerTable[,5], xlab = "soft threshold (power)", ylab = "mean connectivity", type = "n")
text(RpowerTable[,1], RpowerTable[,5], labels = powers1, cex = cex1, col = "red")
横轴是Soft threshold (power)，纵轴是无标度网络的评估参数，数值越高，网络越符合无标度特征 (non-scale)。
我们可以使用系统给的参数帮助我们得到soft threshold，可以是
sft$powerEstimate
#4
给出的是4，因为这个筛选的标准是R-square=0.85，但是我们希望R-square的值达到0.9，所以选择power值为6.
利用power=6计算connectivity，并且可视化无尺度网络图的拓扑结构
betal = 6
k.dataOne <- softConnectivity(datExprdataOne, power = betal) -1
k.dataTwo <- softConnectivity(datExprdataTwo, power = betal) - 1
par(mfrow=c(2,2))
scaleFreePlot(k.dataOne, main = paste("data set I, power=", betal), truncated = F)
scaleFreePlot(k.dataTwo, main = paste("data set II, power=", betal), truncated = F)
筛选连通性最高的3600个基因做为后续分析，不过一般不在这一步进行筛选，因为生物体内的基因网络图更多的是无尺度的。
kCut <- 3601
kRank <- rank(-k.dataOne)
vardataOne <- apply(datExprdataOne, 2, var)
vardataTwo <- apply(datExprdataTwo, 2, var)
restK <- kRank <= kCut & vardataOne >0 & vardataTwo > 0
ADJdataOne <- adjacency(datExpr = datExprdataOne[,restK], power = betal)
dissTOMdataOne <- TOMdist(ADJdataOne)
hierTOMdataOne <- hclust(as.dist(dissTOMdataOne), method = "average")
par(mfrow = c(1,1))
plot(hierTOMdataOne, labels = F, main = "dendrogram, 3600 mast connected in data set I")
层级聚类树展示各个模块, 灰色的为未分类到模块的基因，这里使用的cutreeStaticColor检测module，但是对于复杂的基因结构建议使用 cutreeDynamic。其中也有一些具体的参数可以选择得到合适的module。
colordataOne <- cutreeStaticColor(hierTOMdataOne, cutHeight = 0.94, minSize = 125)
par(mfrow=c(2,1), mar = c(2,4,1,1))
plot(hierTOMdataOne, main = "Glioblastoma data set 1, n = 55", labels = F, xlab = "", sub = "")
plotColorUnderTree(hierTOMdataOne, colors = data.frame(module = colordataOne))
title("module membership data set I")
后续换了一种方法希望得到更多module以期得到更多的eigegene。
dataOne_net = blockwiseModules(datExprdataOne, power = 6, maxBlockSize = 200,
TOMType = "signed", minModuleSize = 30,
reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
saveTOMs=TRUE, corType = "pearson",
loadTOMs=TRUE,
saveTOMFileBase = "DataI.tom",
verbose = 3)
# Calculating module eigengenes block-wise from all genes
# Flagging genes and samples with too many missing values...
# ..step 1
# ....pre-clustering genes to determine blocks..
# Projective K-means:
# ..k-means clustering..
# ..merging smaller clusters...
# Block sizes:
绘制模块之间相关性图
dataOne_MEs <- dataOne_net$MEs
plotEigengeneNetworks(dataOne_MEs, "Eigengene adjacency heatmap",
marDendro = c(3,3,2,4),
marHeatmap = c(3,4,2,2), plotDendrograms = T,
xLabelsAngle = 90)
可视化基因网络 (TOM plot)
load(dataOne_net$TOMFiles[1], verbose=T)
## Loading objects:
## TOM
TOM <- as.matrix(TOM)
dissTOM = 1-TOM
# Transform dissTOM with a power to make moderately strong
# connections more visible in the heatmap
plotTOM = dissTOM^7
# Set diagonal to NA for a nicer plot
diag(plotTOM) = NA
# Call the plot function
TOMplot(plotTOM, dataOne_net$dendrograms,
main = "Network heatmap plot, all genes")
导出网络图
probes = colnames(dat0[,15:69])
dimnames(TOM) <- list(probes, probes)
# Export the network into edge and node list files Cytoscape can read
cyt = exportNetworkToCytoscape(TOM,
edgeFile = "edges.txt",
nodeFile = "nodes.txt",
weighted = TRUE, threshold = 0,
nodeNames = probes, nodeAttr = dataOne_net$colors)
部分参考：
