[摘要]：基因工程实验技术主要内容包括目的基因的获取、重组表达载体构建与转化、阳性克隆的鉴定、目的蛋白的诱导表达、Western Blotting分析检测目的蛋白、目的蛋白的分离和复性、目的蛋白的活性检测。通过本课程的学习使学生系统掌握基因工程实验技术设计思路、基本原理、基本流程和基本操作。以小鼠β-actin基因为实验对象分子，从基因获取到蛋白表达以及最后的活性鉴定，形成一整套基因工程技术流程。小鼠β-actin基因，又名Act、Actx、E430023M04Rik，位于小鼠5号染色体，有6个外显子，编码肌动蛋白家族的一个成员。肌动蛋白是一种高度保守的蛋白质，是真核细胞中含量最丰富的蛋白质之一，与细胞的运动、结构和完整性有关。转录的mRNA的定位、稳定性和翻译是通过多种因子与其3‘UTR序列结合来调节的。该基因的纯合子敲除小鼠表现出胚胎致死性。在小鼠基因组中已经鉴定出该基因的许多假基因。β-actin基因在成人大肠癌、成人脾脏等28种组织中普遍表达。

[关键词] ：小鼠β-actin基因；酶连克隆；Western Blot；表达

Cloning and expression of Mouse β-actin Gene

ZHANG Bo-chao

(Northwest Agriculture and Forestry University, College of Life Sciences, Yang Ling, 10712pm 2017014092, Shengke 173)

ABSTRACT： the main contents of genetic engineering experimental technology include acquisition of target gene, construction and transformation of recombinant expression vector, identification of positive clones, induced expression of target protein, detection of target protein by Western Blotting analysis, isolation and renaturation of target protein, and activity detection of target protein. Through the study of this course, students can systematically master the design ideas, basic principles, basic processes and basic operations of genetic engineering experimental technology. Mouse β-actin gene was used as the experimental target molecule, from gene acquisition to protein expression and final activity identification to form a whole set of genetic engineering technical process. Mouse β-actin gene, also known as Act, Actx and E430023M04Rik, is located on mouse chromosome 5 and encodes a member of the actin family. Actin is a highly conserved protein, which is one of the most abundant proteins in eukaryotic cells, which is related to cell movement, structure and integrity. The localization, stability and translation of transcribed mRNA are regulated by the binding of many factors to their 3'UTR sequences. The homozygous knockout mice of the gene showed embryonic lethality. Many pseudogenes of this gene have been identified in the mouse genome. β-actin gene is widely expressed in 28 kinds of tissues, such as adult colorectal cancer, adult spleen and so on.

Key words： mouse β-actin gene; Western Blot; expression by enzyme-linked cloning

1动物组织mRNA提取

1.1小鼠肝脏获取

使用昆明小白鼠，小鼠处死采用脊椎脱臼法，右手抓住鼠尾用力向后拉，同时左手拇指与食指向下按住鼠头，将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。取出小鼠肝脏，先在预冷的研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末（建议50mg左右）加入已盛有1ml的TRIzol液的离心管中（注意组织粉末总体积不能超过所用TRIzol体积的10%），充分混合均匀。

1.2TRIzol法提取总RNA

TRIzol试剂（如图1B）是一种现成的即用性试剂，旨在在一小时内从人类、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本中分离出高质量的总RNA（以及DNA和蛋白质）。TRIzol试剂是苯酚、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和其他专有组分的单相溶液，有助于分离大分子或小分子大小的各种RNA。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。在样品均化过程中，TRIzol试剂在破坏细胞’溶解细胞成分的同时，由于RNase抑制剂活性的高度作用，保持了RNA的完整性。

TRIzol试剂允许从一个样本中进行RNA、DNA和蛋白质的顺序沉淀。用TRIzol试剂对样品进行匀浆后，加入氯仿，匀浆分离成一个清晰的上层水层(含RNA)、一个间相和一个红色的下层有机层(含DNA和蛋白质)。用异丙醇从水层中沉淀RNA。用乙醇从相间/有机层沉淀DNA。蛋白质通过异丙醇沉淀从苯酚-乙醇上清液中沉淀。沉淀的RNA，DNA或蛋白质被洗涤以除去杂质，然后再悬浮用于下游应用。0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

在冰浴中，迅速将加入1ml的TRIzol液的离心管匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml离心管中，于室温下静置5min。加入200 μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min。4℃，12000r/min离心10min，RNA分布于水相中。将上层无色水相转移到另一离心管中，加入500 μl异丙醇，温和颠转，室温静置10min。4 ℃，12000r/min离心10min。小心弃除上清液，用1ml 75%乙醇（DEPC处理水配置）洗涤RNA沉淀物，重复洗涤一次。室温干燥3~5min。向干燥过的沉淀物中加入50μl的DEPC处理水（无核水）溶解沉淀物，于-20 ℃保存备用。

1.3RNA的快速质量检测

动物细胞内的RNA，主要是rRNA占80%~85%，tRNA及小分子RNA占10%~15%，以及mRNA占1~5%。 rRNA含量最丰富，由25S，18S和5S几类组成。 mRNA种类繁多，分子量从数百至数千减级不等，但绝大多数mi在三端都有一个play尾巴，因此可以根据此特性用寡聚脱氧胸苷（OligodT）层析柱从总RNA中将mRNA分离出来，或者进行其他实验。

在cDNA合成之前评估RNA的完整性。最常见的方法是变性琼脂糖凝胶电泳，其次是溴化乙锭染色。如果18S和28SrRNA在总真核RNA电泳后都出现尖锐的条带，则认为RNA是完整的。28Sr RNA带的强度是18SrRNA的两倍。 任何模糊拖尾的rRNA条带都是降解mRNA的指示。如果发生这种情况，应制备新的总RNA样本。

采用琼脂糖凝胶电泳检测。制备凝胶（1%）。称1g琼脂糖，加100ml0.5×TBS液，加热熔化。冷却至60 ℃，加入10ul核酸染液，混匀后，倒胶。

Marker IV（如图1A）是由单独制备的PCR 产物混合而成，共有6 条DNA 片段（500，1000，2000，3500，5500，7000），已加入上样缓冲液，可直接电泳，每次上样6 μl，为便于电泳后观察，2000 bp 条带最亮，每次用量约为100 ng，其它条带的DNA 每次用量约为50 ng。使用10×Loading Buffer点样，80mA电泳。

如图1C，第一泳道是DNA Marker；第二道及其之后是样本，最亮的两条带分别是28S和18S，下面还有一些杂带。28S的大小约在1.5kb，18S的大学约在800bp，5.8S的大小约在200bp处。

应注意，RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必须在无RNase环境中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处理过夜，然后高压处理或加热至70 ℃ 1小时或60 ℃过夜，以除去石油残留的DEPC。所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶活性。

2RT-PCR扩增目的基因cDNA

2.1RNA的反转录（第一链cDNA合成）

当起始物质为RNA时，采用定量逆转录PCR(RT-qPCR).在这种方法中，RNA首先通过逆转录酶从总RNA或信使RNA(mRNA)转录成互补DNA(cDNA)。然后用cDNA作为qPCR反应的模板。RT-qPCR在基因表达分析、RNAi验证、微阵列验证、病原体检测、遗传检测和疾病研究等方面有着广泛的应用。RT-qPCR可在一步或两步进行。一步检测结合逆转录和PCR在单管和缓冲液中，使用逆转录酶和DNA聚合酶。一步RT-qPCR仅利用序列特异性引物.在两步检测中，反转录和PCR步骤分别在不同的管道中进行，具有不同的优化缓冲器、反应条件和启动策略。

cDNA是指互补（有时称拷贝）DNA。特指在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链。与平常我们所称谓的基因组DNA不同，cDNA没有内含子而只有外显子的序列。真核生物的mRNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。

以结构复杂的RNA或长链RNA为模板进行cDNA合成时，cDNA合成受到抑制的主要原因是RNA高级结构与反转录酶的非特异性结合。并且，由于反转录酶的错配引起的非特异性延伸，对RT-PCR或全长cDNA的合成非常不利。

Thermo Scientific RevertAid第一链cDNA合成试剂盒包含了足够进行100次x20 µL反应的试剂。本品是以RNA为模板高效合成第一链cDNA的完整系统，可合成长达13kb的cDNA。本品含有RiboLock RNase抑制剂，能够有效保护RNA模板不受降解。Thermo Scientific RevertAid第一链cDNA合成试剂盒配套提供oligo(dT)18引物和随机六聚体引物。oligo(dT)18引物可以选择性地与mRNA中的poly (A)尾结合。随机六聚体引物无需poly (A)尾，因此可转录mRNA 5’-端区域，也可以无poly (A)尾的RNA (如micoRNA)为模板合成cDNA。该试剂盒也可使用基因特异性引物。其特点是，可以高效合成长达13kb的全长第一链cDNA，最佳活性温度为42℃，且完全提供RT反应所需的所有组分。

其中，绿色缓冲液包括密度试剂以及蓝色和黄色跟踪染料，允许直接加载反应混合物在凝胶上。蓝色染料在1%琼脂糖凝胶中与3-5kb的DNA片段迁移，在424nm处有激发峰。染料在1%琼脂糖凝胶中迁移速度超过10bp的DNA片段，并在615nm处有激发峰。对于需要荧光激发分析的应用，推荐使用快速消化缓冲液，因为快速消化绿色缓冲液的染料可能会干扰一些荧光测量。

逆转录反应产物可直接用于PCR应用，也可在-20℃下保存不超过一周。对于较长的存储，建议-70℃。

2.2扩增目的基因（第一链cDNA的PCR扩增）

第一链cDNA合成的产物可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA合成反应混合物的体积不应超过PCR反应总体积的十分之一。通常，第一链cDNA合成反应混合物的2µl作为模板，在50µl的总体积中进行后续PCR。

PCR (Polymerase Chain Reaction)法是一种体外扩增DNA的方法。通过以下三个步骤：DNA链的热变性 (Denaturation step)、引物退火 (Annealing step)、聚合酶作用下引物的延伸 (Extension step)。循环往复，可在短时间内扩增DNA达105倍以上。TaKaRa Taq 是一种94 kDa的高纯度耐热性DNA聚合酶，是把Thermus aquaticus YT-1株的DNA polymerase基因在大肠杆菌中表达后，分离提取得到的，与野生型DNA polymerase具有相同的功能。

Premix Taq™ (Ex Taq™ Version 2.0 plus dye)，是PCR反应用的DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture的2倍浓度的混合物。DNA Polymerase使用了扩增效率好的TaKaRa Ex Taq。使用时，只需在制品溶液中加入模板和引物便可进行PCR反应，大大简化了操作过程，减少了PCR操作过程中的污染。本制品扩增性能好，保存稳定性强。

并且，本制品中已含有电泳时所必需的色素试剂(蓝色和黄色色素)，PCR反应后可以直接进行电泳。反应液为鲜艳的绿色 (Emerald Green)，电泳时指示效果明显，容易观察样品的电泳位置。使用该酶扩增得到的PCR产物的3’端附有一个“A”碱基，因此可直接克隆于T-Vector中。 使用该酶的反应液5μl，1% Agarose电泳时，蓝色色素在3～5 kb附近，黄色色素在50 bp以下位置。

值得注意的是，不同的DNA片段要达到最高的扩增效率，需要设定不同的反应条件。PCR反应液请于冰中配制，然后进行PCR反应。这种冷启动法 (Cool Start Method) 可以增加PCR扩增的特异性，得到良好的PCR扩增结果。PCR反应液电泳时，最好使用TAE Buffer。使用TBE Buffer电泳时，样品沉降速度较慢，有可能造成电泳样品漂出加样孔。

2.3琼脂糖凝胶电泳检测表达引物扩增目的基因

采用琼脂糖凝胶电泳检测。制备凝胶（1%）。称1g琼脂糖，加100ml的0.5×TBS液，加热熔化。冷却至60 ℃，加入10ul核酸染液，混匀后，倒胶。

D2000（如图1A）是由单独制备的PCR产物混合而成，共有6条DNA片段（100，250，500，750，1000，2000），已加入上样缓冲液，可直接电泳，每次上样6μl，为便于电泳后观察，750 bp条带最亮，每次用量约为100 ng，其它条带的DNA 每次用量约为50 ng。

如图2A，泳道1是D2000，泳道2-6是由克隆引物扩增出的PCR片段B1-Act-B2，泳道7-9是质粒小提的pGEX 4T-1作对照。显然，片段B1-Act-B2分布在250bp-500bp的位置。

如图2B，泳道1是D2000，泳道2-9是由表达引物克隆的PCR片段EB1-Act-EB2。显然，片段EB1-Act-EB2也分布在250bp-500bp的位置。

3质粒提取

3.1质粒小提试剂盒法提取质粒

质粒提取主要采用碱裂解法。人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

质粒小提试剂盒采用先进的硅胶膜吸附技术，操作简单、快速。菌体经碱裂解法处理后通过离心吸附柱，专一性结合DNA，洗去杂质，高效快速提取多至30 μg 的质粒DNA。本试剂盒采用独特的缓冲液配方，最大限度去除蛋白杂质及其它有机化合物，每次可处理1-5ml菌液。得到的DNA 比传统试剂盒纯度更高，可直接用于酶切、转化、测序及PCR 等分子生物学实验。

TIANGEN的质粒提取试剂盒既适用于革兰氏阴性菌中质粒的提取，同时也可从革兰氏阳性菌中提取质粒。由于革兰氏阳性菌有一层较厚的细胞壁，会严重阻碍细菌细胞的裂解，因此必须在裂解细胞前破除，其破除方法如下：收集适量的菌体，加入250 μl溶液P1或TE，充分悬浮菌体，加入溶菌酶使其终浓度为10-20 mg/ml，37℃处理30 min左右。加入溶菌酶的浓度和处理的时间可根据不同的菌株和具体实验条件进行调整。

其中用到三种溶液以及硅酸纤维膜（超滤柱）。溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖/25mMTris-HCl/10 mMEDTA，pH 8.0，主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH/1%SDS，此步为碱处理，其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化；溶液Ⅲ：3 M醋酸钾/2 M醋酸/75%酒精作用是沉淀蛋白和中和反应，其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS。

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（使用当天处理过的柱子）取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1（先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复操作PW步骤。将吸附柱CP3放入收集管中,12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

溶液P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。使用前请先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12000rpm。提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。用平衡液BL处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、 ET12567、JM系列）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。

3.2琼脂糖凝胶电泳检测质粒

采用琼脂糖凝胶电泳检测。制备凝胶（1%）。称1g琼脂糖，加100ml0.5×TBS液，加热熔化。冷却至60℃，加入10ul核酸染液，混匀后，倒胶。

如图2A，泳道7-9是质粒小提的pGEX 4T-1，质粒状态良好，条带明显。

4表达载体和目的片段的酶切

4.1载体与片段的酶切

pGEX-4T-1载体，是一种高拷贝大肠杆菌表达载体，全长4969 bp，含有N-GST标签，氨苄青霉素抗性，启动子是Tac，复制子是pMB1。Tac启动子是Trp启动子和Lac启动子杂合组成的，所以Tac启动子在绝大部分的e. coli都是可以表达，比如DH5a、BL21、JM109等，一般选择BL21系列的作为表达宿主，是因为其为蛋白酶缺陷，异源表达水平较高。BL21（DE3）菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。

Thermo Scientific BamHI限制性内切酶识别5'-G^GATCC-3'位点，使用通用的FastDigest缓冲液在37℃时剪裁效果最好。Thermo Scientific SalI 限制性内切酶识别5'-G^TCGAC-3'位点，使用通用快速消化缓冲液在37℃范围内切割效果最好。BamHI和SalI 是一个先进的快速限制酶系列之一，这些酶在通用快速消化和快速消化绿色反应缓冲器中都具有100%的活性。

4.2载体与片段酶切产物的回收

使用Universal DNA纯化回收试剂盒纯化DNA片段。本试剂盒采用独特的缓冲体系和离心吸附柱，既可从TAE 或TBE 琼脂糖凝胶中回收DNA片段，又可用于直接纯化PCR产物，能够满足多种实验需要。溶胶液PC中含有pH 指示剂，可根据颜色来判断溶胶状态。使用本产品可回收100bp- 8kb大小的DNA片段，回收率可达80%。使用本试剂盒回收的DNA可直接用于连接、转化、酶切、测序等分子生物学实验。

平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温/潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响。使用前请先检查平衡液BL是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热数分钟，即可恢复澄清。电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液。切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加10-30 µl 3 M醋酸钠（pH5.2）将pH值调到5-7之间。回收<100 bp及>10 kb的DNA片段时，应加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。回收率与初始DNA量和洗脱体积有关，初始量越少、洗脱体积越少，回收率越低。

对于酶切质粒采用切胶回收，使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。向胶块中加入等倍体积溶液PC（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100µl，则加入100µl的PC溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。重复PW操作。将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。为了提高DNA的回收量，将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。

对于酶切PCR产物采用液体回收，估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油），加入后静置2min，其他步骤同上。

如图3A，泳道1是MarkerⅣ，泳道2-4是pGEX 4T-1质粒由BamHⅠ和SalⅠ酶切后纯化回收的PCR片段pGEX-BS。显然，双酶切后的质粒分布在3500bp-5500bp的范围。如图3B，泳道1是D2000，泳道2是由表达引物克隆的PCR片段EB1-Act-EB2，泳道3和5是EB1-Act-EB2由BamHⅠ和SalⅠ酶切后纯化回收的PCR片段EB-Act-BS，泳道4和6是pGEX 4T-1质粒由BamHⅠ和SalⅠ酶切后纯化回收的PCR片段pGEX-BS。显然，双酶切后的PCR片段分布在250bp-500bp的范围。如图3C，泳道1是MarkerⅣ，泳道2-7是纯化回收的PCR片段pGEX-B和纯化回收的PCR片段EB-Act-BS连接后的重组质粒pGEX-EB-Act。

5载体和外源DNA 的连接

在双链DNA或RNA中，T4 DNA连接酶催化5‘-磷酸和3’-羟基末端之间形成磷酸二酯键。 该酶修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交中的单链缺口，将DNA片段与粘性末端或平末端连接起来。T4 DNA配体酶需要ATP作为辅助因子。

需注意，粘性末端的连接与平末端不同，粘性末端如下：

电转化效率可通过以下方法提高：T4 DNA连接酶在65°C下热失活10分钟或70°C下热失活5分钟；DNA纯化，可以使用JETP CR纯化试剂盒或氯仿提取。通过将反应时间延长到1小时，可以增加转化子的总数。如果在20μl反应混合物中使用超过2WeissU的T4 DNA连接酶，则在电转化前需要纯化DNA（通过自旋柱或氯仿萃取）。

聚乙二醇(PEG)大大提高了平末端DNA连接的连接效率。连接反应混合物中PEG4000的推荐浓度为5%(w/v)。不要超过推荐量的T4 DNA配体在回收混合物。将T4 DNA配体与DNA结合可能导致琼脂糖凝胶中的条带转移。为了避免这一情况，用6×Loading Dye和SDS Solution在65℃下孵育10分钟，并在加载前在冰上冷却。为了有效转化，连接反应混合物的体积不应超过主管细胞体积的10%。

6感受态细胞的制备与转化

6.1感受态细胞的制备

主要采用CaCl2法制备感受态细胞。取-70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜.次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。当菌落600nm OD值达到0.3-0.4时，将烧瓶取出放置冰上10~15分钟，在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃，4000g离心10分钟。弃上清，将管倒置于干滤离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。4℃,4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液.加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体.每管0.2ml分装，至4℃保存备用，24-48小时内使用效果较好.如果暂时不用，可再保存于-70℃的低温冰箱中。

本次使用天根生化科技（北京）有限公司的TOP10感受态细胞(CB104)。该公司生产的TOP10感受态细胞是采用大肠杆菌TOP10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可达1亿以上，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。质量稳定，使用方便，质优价廉。

6.2转化

将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。细胞壁通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

7重组质粒的筛选、鉴定及转化

7.1菌落PCR的快速鉴定

菌落PCR（Colony PCR）可不必提取目的基因DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物来筛选阳性克隆。通常利用此PCR的方法进行筛选插入的目的基因或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的片断大小。

用高压灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落。先在抗性平板上（LB+Amp）点单克隆保存（标记），然后置于10ul 去离子水中搅和一下。将装有10ul去离子水的EP管在100°C下煮2分钟。取1ul上清为模板，加入PCR体系进行PCR反应，建议PCR体系为20ul。

用特异性引物进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳观察结果。挑选对应的阳性克隆菌落。

如图4A，泳道1是D2000，泳道2-16是15个重组质粒pGEX-EB-Act样品菌落PCR的结果，显然，样品4和11为阴性，但仍然不能排除除了样品4和11之外不存在假阳性的可能，还需经一部验证。

7.2重组质粒酶切鉴定

依据菌落PCR结果，挑选阳性重组质粒，参照3.1试剂盒法小提质粒，70ulEB洗脱重组质粒。

按照下表加入PCR管（30ul体系）：

每管加入3ul的10×loading Buffer终止反应，琼脂糖凝胶电泳查看结果。

如图4B，泳道1是D2000，泳道2-3是重组质粒pGEX-EB-Act的BamHⅠ单酶切产物pGEX-EB-Act-B，泳道4-9是重组质粒pGEX-EB-Act的BamHⅠ和SalⅠ酶切后的PCR片段pGEX-EB-Act-BS，泳道10是重组质粒pGEX-EB-Act，泳道11是pGEX 4T-1质粒由BamHⅠ和SalⅠ酶切后纯化回收的PCR片段pGEX-BS，泳道12是EB1-Act-EB2由BamHⅠ和SalⅠ酶切后纯化回收的PCR片段EB-Act-BS。显然，测试的6个样品均为阳性。

7.3重组质粒转化

重组质粒转化使用天根公司生产的BL21(DE3)感受态细胞，该细胞是采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可达107，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。该菌株用以T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。

T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。转化方法参见6.2重组质粒转化表达TOP10感受态细胞。注意设置大肠杆菌BL21(DE3)空菌、pGEX 4T-1空质粒对照。

8目的基因的诱导表达与Western Blot

8.1诱导靶蛋白表达

分别挑取对照菌和重组菌1-2个菌落，接入5ml含有Amp（30ug/ml）的LB培养液，37℃震荡培养8-10h，向诱导管中加入IPTG，28℃培养过夜。

8.2Western Blot

蛋白免疫印迹是经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。在蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开；在DNA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，DNA呈双链状态泳动，其迁移率会受碱基组成和序列的影响。在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于加入了变性剂——蛋白质变性剂常为SDS（SDS-PAGE），核酸变性剂常为尿素、甲酰胺等，故其分离仅依据于分子量大小。在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子表面活性剂和强还原剂（SDS，即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。SDS是阴离子去表面活性剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。

8.2.1电泳

首先，清洗玻璃板，玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

配20ml的10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

配12.5ml的4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

将表达的蛋白溶液按照等比例加入1×SDS上样缓冲液混合，上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品。上样前要将样品于沸水中煮10min使蛋白变性，Maker煮5min。沸水浴后12000rpm离心30s，放置冰上用上清液来点样电泳。加足够的电泳液后开始准备上样（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

电压为30V较好，后可用50V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。考马斯亮蓝R250染色2h以上，后过夜脱色。

8.2.2杂交

转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的NC膜或PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的NC膜或PVDF膜置于水上浸2h才可使用。用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）。在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）。

将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰，或将转移槽埋于冰水混合物中来降温。一般150mA转移2h。

转完后将膜用TBS冲洗一次，室温下，用含10%脱脂奶粉的TBS封闭硝酸纤维素膜1h。倒去封闭液，用TTBS（含0.1%的吐温-20）洗膜10min。取1ul的anti-GST单克隆抗体（一抗，Anti GST-Tag Mouse Monoclonal Antibody，鼠单克隆抗体IgG1，该抗体为高纯度的鼠单克隆抗体，与GST结构域具有高亲和性，可灵敏特异地检测各种GST编码载体表达的GST-Tag融合蛋白。），稀释在500ul含有2%脱脂奶粉的TTBS（含吐温-20，0.1%）中，将稀释的一抗均匀点在硝酸纤维素膜上，注意排除气泡，4℃过夜。

用TBS洗膜2次，TTBS（含吐温-20，0.1%）洗1次，每次需持续10min。取1ul的Goat-Anti-Mouse-IgG-HRP（二抗，Goat Anti-Mouse IgG, HRP Conjugated，HRP即辣根过氧化物酶，可以催化DAB、TMB等底物显色或催化ECL等化学发光试剂产生化学反应而发光。本产品为辣根过氧化物酶标记的经亲和纯化的山羊抗体，特异识别小鼠IgG重链和轻链，检测灵敏度高，本底低，对其他种属IgG无明显交叉反应，可用于Western Blot、ELISA和免疫组化检测。） ，稀释在500ul含2%的奶粉的TTBS（含吐温-20，0.1%）中，同样，将稀释的一抗均匀点在硝酸纤维素膜上，注意排除气泡，25℃放置1h。

用TTBS（含吐温-20，0.1%）洗膜4-5次，将硝酸纤维素膜装入杂交袋或培养皿。在离心管中配置BAD显色液（30min内有效，避光保存）。在杂交袋或培养皿中加入显色液，室温下避光显色5-10min，当有清晰的棕褐色条带出现时，用水洗涤终止反应。观察结果，干燥保存。

Western Blot的转模如图6A，泳道1是未诱导的空质粒pGEX 4T-1，泳道2是诱导的空质粒pGEX 4T-1，泳道3是标准蛋白质，泳道4、6和8是未诱导的重组质粒，泳道5、7、9和10是诱导的重组质粒。β-actin蛋白由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右，显然，诱导的重组质粒在43kDa附近有蛋白条带，而未诱导的重组质粒在43kDa附近未发现有蛋白条带。SDS-PAGE凝胶电泳图如图6B，泳道分布上同。