开发脑靶向肽基MMP-9抑制纳米颗粒,用于治疗MMP-9活性升高的脑疾病

期刊预打样

开发脑靶向肽基MMP-9抑制纳米颗粒,用于治疗MMP-9活性升高的脑疾病。

Yamir Islam, Khalid Aneesa, Stefano Pluchino, Muttuswamy Sivakumaran, Meritxell Teixidò, Andrew Leach, Amos A. Fatokun, James Downing, Christopher Coxon, Touraj Ehtezazi。

皮伊: S0022-3549(20)30354-3 多伊:
https://doi.org/10.1016/j.xphs.2020.0 6.021 参考资料: 1998年
要出现在: 药学杂志
收到日期:2020年4月20日 修订日期: 102020年6月 接受日期:2020年6月23日
请引用这篇文章为:IslamY,AneesaK,PluchinoS,SivakumaranM,TeixidoM,LeachA,FatokunAA, DowningJ,CoxonC,EhtezaziT,开发基于MMP-9抑制纳米粒子的脑靶向肽治疗脑疾病与MMP-9活性升高, 药学杂志(2020年),DOI:。https://doi.org/10.1016/j.xphs.2020.06.021
这是一篇文章的PDF文件,在接受后进行了增强,例如添加了封面页和元数据,以及为可读性设置了格式, 但它还不是记录的最终版本。 本版本将在出版前进行额外的编辑、排版和审查 在它的最终形式,但我们提供这个版本,以提供文章的早期可见性。 请注意,在生产过程中,可能 会发现可能影响内容的错误,以及适用于期刊的所有法律免责声明。
©2020年由Elsevier公司代表美国药剂师协会出版。

开发脑靶向肽基MMP-9抑制纳米颗粒,用于治疗MMP-9活性升高的脑疾病

Yamir Islam,1 Khalid Aneesa,1 Stefano Pluchino,2 Muttuswamy Sivakumaran,3 Meritxell Teixido,4 安德鲁·莱奇,1,b Amos A。 法托昆,1 詹姆斯·唐宁,1 Christopher Coxon,1,a TourajEhtezazi,1*

1利物浦约翰摩尔大学药学和生物分子科学学院,利物浦,L33AF,英国 2临床神经科学系,CliffordAllbutt建筑-剑桥生物科学校园和NIHR生物医学研究中心,剑桥大学,

Hills路,CB20HA剑桥,英国。 3海姆科,彼得堡市医院,伊迪丝卡维尔校园,布雷顿门彼得堡, PE39GZ,彼得堡,英国。

4生物医学研究所(IRB巴塞罗那),巴塞罗那科学技术研究所(BIST),Baldiri Reixac10,巴塞 罗那08028,西班牙。

a目前地址:爱丁堡赫里奥特瓦特大学工程和物理科学学院化学科学研究所,EH144AS

b现住址:英国曼彻斯特大学药学院 *相关作者:t.ehtezazi@ljmu.ac.uk

摘要

脑基质金属蛋白酶9 (MMP-9)的潜在和活性水平在神经系统疾病和脑损伤中升高,导致神经系统损伤和临床结果差。本研究旨在开发具有穿越血脑屏障(BBB)和抑制MMP-9能力的肽基纳米颗粒。

合成了3个含脑靶向配体(HAIYPRH或CKAPETALC)与MMP-9抑制肽(CTTHWGFTLC)结合的两亲性肽段(HAIYPRH或CKAPETALC),这些肽段在N-末端由甘氨酸(spacer)连接,并与胆固醇结合。采用19F-NMR测定MMP-9抑制率。用乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞毒性,用/不用胎牛血清进行透析研究。采用体外模型评价纳米颗粒通过血脑屏障的能力。

两亲性肽(胆固醇- gggctthwgftlchaiyprh)形成纳米颗粒
(平均尺寸为202.8 nm)具有跨越BBB模型的能力。MMP-9抑制
-6 -1纳米颗粒对细胞无毒,可将4.5×10 s的kobs降低至MMP-9活性
完全抑制。透析研究表明,纳米颗粒在40倍的极端稀释下不会分解,但会被血清酶逐渐水解。

综上所述,抑制MMP-9的纳米颗粒降低了MMP-9的活性,且具有可接受的血清稳定性、最小的细胞毒性和通过体外血脑屏障模型的能力。
关键词:MMP-9抑制剂、纳米颗粒、脑给药、血脑屏障。

1. 介绍

基质金属蛋白酶(MMPs)属于metzincin家族。1在人类中,已经发现了23种不同的基质金属蛋白酶2,它们被分为溶解型基质金属蛋白酶和膜结合型基质金属蛋白酶3。基质金属蛋白酶可分为胶原酶、明胶酶、溶酶和母系溶酶4。MMPs共同代谢细胞外基质。1,3,5

基质金属蛋白酶9 (MMP-9)或明胶酶B是MMPs家族中的一员。MMP-9不仅代谢变性胶原6,而且分解各种胶原,激活和修饰细胞因子和趋化因子7。MMP-9在中枢神经系统和外周神经系统中表达。MMP-9在神经系统疾病如创伤性脑损伤8、和多发性硬化症(MS)中表达升高9;其高水平被认为与不良预后有关。8Kumari等2011年研究表明,与db/+小鼠相比,db/db小鼠的同侧半球中MMP-9的蛋白水解活性显著增加,这增加了db/db小鼠发生梗死的几率。10 MMP-9的表达与卒中的严重程度和不良预后相关,推荐临床试验作为拮抗MMP-9的药物。11

各种各样的努力已经开发了抑制MMP-9部分或全部。例如,Nyormoi等人2003报道了一种具有抗肿瘤活性的MMP-9抑制因子(化合物5a)。此外,他们还报道了化合物5a并没有直接作用于mitochondia,但它通过配体-受体相互作用和caspase 8的激活表现出抗肿瘤活性12。另一个例子是,选择性MMP-9抑制剂外消形的ND-336比becaplermin具有更高的愈合能力,因为MMP-9促进了糖尿病足溃疡的损伤作用13。一些MMP-9抑制剂已经被报道,如GS-5745,14和AQU-118, 15但仍然需要鉴定一种具有阿片活性和较少毒性的抑制剂。为了达到这个目标,MMP-9-siRNA被结合到量子上点的尺寸为15纳米。目的是下调MMP-9在脑2中的表达微血管内皮细胞。16利用磁性平台引导纳米颗粒(NPs)进入大脑,将内源性基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1表面吸附在直径为10 nm的磁性NPs上。在静磁体作用下,NPs通过人体外血脑屏障(BBB)模型。17

在另一项研究中,我们开发了加载TIMP-1的聚乳酸-乙醇酸(PLGA) NPs来增强TIMP-1到大脑的传递。NPs包覆聚山梨酯80 (PS80),静脉注射后穿透血脑屏障。18另一方面,在另一项工作中,PLGA NPs (260nm)被PS80包裹,PS80含有-胡萝卜素(减少器官中的氧化应激)。经静脉给药后,这些NPs大部分积累在肺而不是大脑中(肺中2000 nmol/g,而大脑中0.2 nmol/g)。19本研究表明NPs应饰以脑靶向配体以治疗脑疾病。20此外,Chen等人发现,具有WPFYGTP表位的相关腺病毒(AAV)靶向大脑的效率是肝脏的35倍。有趣的是,带有野生型小鼠脑微血管表位的AAVs对粘多糖病VII型小鼠脑无效。20因此,脑靶向配体可能适用于某些疾病,但不适用于其他疾病。因此,脑靶向配体的选择应与脑疾病相关。尽管上述方法是抑制脑疾病中MMP-9的有效方法,但需要通过静脉注射特异性靶向大脑的纳米颗粒来抑制MMP-9几个小时,但这些纳米颗粒会被大脑/系统降解。这是因为,人类研究表明,对MMP-9抑制的有效治疗窗口期是创伤性脑损伤后72小时。21一般认为,MMP-9等MMP-9在脑缺血早期具有有害作用,但对脑血流重建和血管生成有促进作用。22-25

具有MMP-9抑制特性的二甲胺四环素26已被用于治疗中风的临床试验并取得了成功。27然而,由于需要高剂量(10 mg/kg),而且药物的毒性对一些病人来说是致命的。27最近的另一项临床试验表明,对患者使用二甲胺四环素(200mg /day) 6个月可以防止从临床孤立脱髓鞘综合征转变为多发性硬化的风险。28然而,二甲胺四环素的副作用(皮疹、头晕和牙齿变色)在接受二甲胺四环素治疗的患者中很常见,并且在某些情况下会导致退出试验。28这进一步表明了使用脑靶向给药系统(如纳米颗粒或纳米载体)以最小化药物副作用的必要性。给选择性MMP-9抑制剂(SB 3CT)改善长期的神经行为在小鼠模型的创伤性脑损伤后腹腔内给药。29SB 3CT及其代谢物ρ-哦3 ct快速吸附和分发给大脑,然而,29SB 3CT展品水溶性差,可能阻止其使用在临床试验中发现以来在2000。30因此,显然需要大脑针对MMP-9抑制剂以最小的副作用,低成本和可伸缩性。

本研究受到Koivunen, E.等人1999年工作的启发,他们发现合成的肽CTTHWGFTLC(环二硫键)是mmp -9,的有效抑制剂,31尽管已有其他MMP-9抑制肽的报道。32-34此外,CTTHWGFTLC是一种水溶性肽31,肽段较短,在大规模生产中具有优势。本研究旨在合成自组装形成NPs的两亲性肽,结合MMP-9抑制肽,具有穿越血脑屏障的能力,用于治疗神经退行性疾病和脑损伤。本研究开发了含有脑靶向肽序列(HAIYPRH) [HAI peptide]的NPs,但不适用于特定的脑疾病(图1)。我们进行了体外实验,以评估NPs抑制MMP-9酶的效果以及这些NPs的细胞毒性。

本研究采用hCMEC/D3细胞系建立静态体外血脑屏障模型。35,36两亲性肽曾被开发用于脑靶向,37,38但并未用于脑疾病如卒中或ms的治疗。本研究证实了含有MMP-9抑制肽的脑靶向NPs能够降低MMP-9活性并穿越血脑屏障。

2. 材料和方法

2.1材料

所有L-Fmoc氨基酸、Oxyma和ProTide®树脂均来自CEM(白金汉,英国)。N, N ' -Diisopropylcarbodiimide (DIC)、哌啶、胆甾醇氯甲酸酯(瑞士法郎),三氟乙酸(组织),triisopropylsilane (TIPS),乙腈,甲酸和N, N -二异丙基乙胺(DIPEA) trizma基础(三),氯化钠,Brij35, N - (3 - Aminopropyl)甲基丙烯酰胺盐酸盐(APMA)和纤维素透析管与分子量截止10000年来自Sigma-Aldrich(英国多塞特郡)。Fmoc-L-4-氟苯丙氨酸来自Fluorochem®(Hadfield, UK)。二甲基甲酰胺(DMF)、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(PAN)和乙醚来自Acros Organics®(拉夫堡,英国)。MMP-9重组人蛋白、His标签(10327H08H5)、Pierce LDH细胞毒性检测试剂盒和二水合氯化钙(CaCl2)均来自ThermoFisher Scientific®(Paisley, UK)。hCMEC/D3细胞系和补充(endogrol - ls补充剂、rh EGF、l -谷氨酰胺、氢化可的松半胱氨酸、硫酸肝素、抗坏血酸和胎牛血清)的endogrol - mv试剂盒培养基购自美国马萨诸塞州Merck Millipore公司。使用的通道号为1-11号,批号为3130216。碳涂层铜网格来自Agar Scientific Ltd (Stansted, UK)。分子量为70 kDa的fitc -右旋糖酐购自Sigma-Aldrich(英国多塞特)。聚对苯二甲酸乙二醇酯0.4um插入物(Sarstedt, Leicester, UK)由Sarstedt公司获得。

2.2.方法

2.2.1.固相肽合成(SPPS)

使用CEM Liberty Blue®自动微波辅助肽合成器合成肽。39简单来说,将147毫克Rink Amide ProTide树脂(负载容量0.61 mmol/g)转移到一个反应容器中,并在DMF中膨胀。典型的Fmoc脱保护要求20%哌啶在DMF中在90℃持续90秒。用1 M的DIC溶液和Oxyma溶液分别作为激活剂和偶联剂。用0.2 M的氨基酸溶液在DMF中合成。除半胱氨酸(Cys)在50℃偶联和精氨酸(Arg)在75℃偶联外,氨基酸在90℃偶联。

2.2.2.液相色谱-质谱(LC/MS)分析

通过高效液相色谱(HPLC)、液相色谱和质谱(LC/MS)验证了合成的有效性。39肽合成完成后,将肽分别分散在1ml MeOH和0.1 mL水中,超声分离15分钟直到完全分散,然后用液相色谱-质谱(Waters 2695分离模块连接Quattro Premier Micromass)进行鉴定。样本准备在水的混合物,乙腈和甲酸(80%:20%:0.1%)和分离(20μL注入)XBridge®肽本·C18柱(130̆,5μm和4.6毫米x 150毫米)使用梯度洗脱的两个移动阶段(a -水:甲酸99.9%:0.1%,B -甲醇:甲酸;99.9%: 0.1%)。使用LC/MS (ESI处于正/负切换模式,质量范围为0-2000 Da)确认现有肽以及其他分子/杂质的所需m/z。串联质谱在数据库中搜索所需的m/z。分析使用MassLynx质谱软件(Waters)。

2.2.3.高效液相色谱(HPLC)

如前所述,用高效液相色谱法对合成肽进行了表征。39HPLC分析采用 Agilent 1200系列。少量的样品溶解在1ml MeOH和0.5 mL去离子水中。注射体积为20毫赫兹,紫外检测波长为224-280纳米。Phenomenex C18高效液相色谱柱(3.6×m粒径,4.6×150 mm柱),以MeOH / H2O(18分钟梯度:5-95%,0.1%甲酸)组成的二元洗脱体系为流动相。工作压力在2000- 3000psi范围内。

2.2.4.CHF与肽的结合

一旦肽序列合成和化学结构分析,CHF开始结合产生两亲性肽,如之前报道的37。简单地说,在40℃条件下,将多肽肽(1 eq.根据负载容量0.61 mmol/g)添加到含有CHF (2 eq.)和DIPEA (4 eq.)的DMF (4 mL)溶液中。Kaiser试验用于评估偶联的完整性,重复此过程直到偶联完全。将两亲性肽与5 mL裂解鸡尾酒[由黄芪皂苷(TFA)、TIPS和水(9:0.5:0.5 v/v)]在室温下有规律地摇动4 h,从树脂中裂解,然后将溶液过滤到冰冷的乙醚中,离心。沉淀两亲性肽在乙醚中反复重悬,离心3次。乙醚在冰箱里过夜就蒸发了。将两亲性肽分散在水中,快速冷冻,冷冻干燥,得到的共轭肽为粉末。没有采取进一步的步骤来环化肽中的半胱氨酸氨基酸或纯化共轭肽。在结合肽裂解/沉淀后,通过冻干去除多余的TFA。因此,共轭肽是一种TFA盐。

2.2.5.MMP-9酶激活

酶的激活是通过遵循制造商的协议来实现的。TCNB缓冲区(三羟甲基氨基甲烷(50毫米)液、CaCl2(10毫米),NaCl(150毫米)和Brij 35(0.05%)]准备使用Trizma基础(Tris)浓度的200mM,二水氯化钙的浓度(CaCl2)40mM,NaCl浓度的600mM(NaCl),Brij35浓度为0.2%。每个组分分别溶解在10毫升无菌水中,然后从每个溶液中取出1毫升转移到另一个容器中,达到所需的浓度。对5倍的MMP-9 (ThermoFisher, REF - 10327-H08H-5, LOT - lcl09au0402),以100倍的增量向TCNB缓冲液中加入900倍的MMP-9 (ThermoFisher, REF - 10327-H08H-5, LOT - lcl09au0402)以溶解样品。然后加入APMA 100 mol / L,浓度为1 mM,最终得到浓度为64.4 nM的MMP-9溶液。此溶液在37℃下孵育24小时。随后,加入3 mL TCNB缓冲液制备16 nM的MMP- 9溶液。将1ml的该溶液在TCNB缓冲液中进一步稀释至8ml,得到2nm的溶液用于核磁共振研究。

2.2.6款.动态光散射(DLS)分析和Zeta电位测量

使用Malvern Zetasizer Nano ZS®(Malvern,伍斯特郡,英国)测量颗粒大小,其中包含一个氦氖激光源(λ= 632.8 nm,输出功率为22 mW)。所使用的试管为DTS0012。水的折射率为1.3,粘度为0.9 cP。对分散在水中的两亲性肽样品进行了三次检测。同样的仪器也被用来测量zeta电位。所有的测量都进行了三次,同时计算了平均值和标准差(SD)。

2.2.7.透射电子显微镜

利用FEI Morgagni透射电子显微镜对肽纳米载体进行了形貌观察和表征。采用碳膜铜网格。用蒸馏水配制2.5 mg/mL肽溶液。一小滴肽溶液被放置在网格上并让其干燥。样品干燥后用透射电镜进行分析。未染色(阴性或阳性)。

2.2.8.制备纳米颗粒分散

用无菌去离子水制备纳米颗粒分散体。程序在一个消毒的层流箱中进行,以制备2.5 mg/mL的两亲性肽悬液。将悬浮液进行浴超声处理1 h和45 min,以160 W(有效80 W)的超声功率分散两亲性肽颗粒,形成纳米颗粒胶体分散体VWR超声清洗剂USC 300 TH 2.8 L 45 kHz (VWR International)。

2.2.9.透析

将大约15cm透析管浸泡在装有水的烧杯中5分钟。在一个单独的烧杯中,加入40毫升的蒸馏颗粒游离水,并用磁搅拌棒搅拌。一旦管变灵活,一端系结,将1ml两亲性肽纳米载体悬液放入管内,另一端系结密封。然后将其放入含有磁棒的40毫升水中(稀释40倍);用橡皮筋固定,然后烧杯放在搅拌板上。荧光分光光度计上的参数设置为激发在270 nm,发射开始在300 nm,停止在400 nm,狭缝宽度设置为20 nm。使用荧光分光光度计(VARIAN CARY Eclipse,英国),只用水在四面透明石英试管中测量背景荧光。当时周围的水的荧光强度测试时间分别是0,1,2,3,4,5,6,24 点。在每个采样时间点,3毫升(1 x 3毫升)以外的透析袋放在4-clear试管和分析使用荧光分光光度法和强度测量来确定两亲性肽通过透析膜的释放。每次测试后,每个样品返回烧杯,以保持体积在40毫升。

然后,将NPs分散在胎牛血清(FBS)中,用蒸馏水在袋子外面进行同样的透析程序。所有的释放研究重复了三次。

2.2.10.酶抑制研究和酶动力学评价

使用Bruker®AscendTM 600 MHz NMR光谱仪进行酶学研究(NPs的抑制作用)。一维(1D)氟-19 (19F;采用室温(298 K)质子解耦的方法进行核磁共振实验,采用国内研制的含有4-氟苯丙氨酸的高灵敏度MMP-9肽(TY-26,结果将另行发表)分析NPs的抑制作用。将一份MMP-9敏感肽(5 mg/mL)样品(350°L)和400°L活化的MMP-9加入到核磁共振管中。这是对照样本。在第二核磁共振管中加入相同的溶液和350mol / L的MMP-9抑制纳米载体水分散体作为测试样品。含4-氟苯丙氨酸的肽产物和代谢物被观察为具有不同特征化学位移的单线体。化学位移值被校准为TFA (-76.55 ppm)作为内部标准。使用TopSpin®查看和分析获得的数据,使用Dynamics centre 2.4.5 (Bruker®)处理和计算酶动力学。通过评估TCNB缓冲液中的MMP-9敏感肽以及MMP-9无反应肽(TY-27: GGYGQ- GYW19FG)在MMP-9存在下的降解情况,我们进行了进一步的对照试验。

2.2.11.细胞死亡诱导的评估

用乳酸脱氢酶(LDH)测定MMP-9抑制NPs的潜在毒性。HeLa细胞在添加了10%胎牛血清和2 mM l -谷氨酰胺的改良Eagle培养基(DMEM)中生长。然后用磷酸盐缓冲的生理盐水清洗,胰酶处理,重新悬浮在生长培养基中,计数并接种到不透明的、微透明的、平底的96孔组织培养板中,密度为7.5×104个细胞/mL(7500个细胞/孔,100L/孔)。空白对照组中不含细胞(仅含完全培养基)。实验设计包括3个重复孔,用于LDH测定对照组。然后将96孔板在37℃、5% CO2的条件下孵育过夜。然后将纳米载体一式三份加入培养孔中。在阴性对照孔中加入无菌水。将处理过的96孔板在37℃、5% CO2的条件下孵育24小时,然后按照制造商的方案(ThermoFisher, Pierce LH细胞毒性检测试剂盒,Cat)进行LDH检测。88953号)。包含在设计是一个自发的LDH活性控制(10μL无菌水,获取最低LDH释放,也就是说,完全代表0%健康细胞LDH释放)和最大LDH活性控制(10μL (x裂解缓冲,将完全溶解细胞,表明100%的LDH释放)。然后,将96孔板在37℃、5% CO2的条件下再孵育45分钟。在此孵育之后,从每个测试井或控制井中取出50百里升的培养基转移到一个新的96孔平底板中。然后在每个孔中加入50立方摩尔的反应混合物,轻轻地敲击板子。在室温下孵育30分钟,并盖上锡箔以避光,然后在每个孔中加入50°L的停止溶液(强酸),轻轻敲打混合。任何产生的气泡都用注射器针头去除。然后使用Clariostar平板阅读器(BMG Labtech),从阴性控制值和每个处理值中减去空白孔(不含细胞)的值。在680 nm处的合成值减去480 nm处相应的合成值。然后,通过将阴性对照的值或每个处理的值表示为LDH最大释放值的百分比来分析这些最终值。研究了三种细胞传代。

2.2.12.血脑屏障体外模型制备及移行实验

体外血脑屏障模型采用Merck Millipore公司提供的方案构建。通过体外血脑屏障模型,利用永生化的人脑内皮细胞系hCMEC/D3,研究血脑屏障的通透性。简单地说,90000个细胞接种在24孔的TC-inserts中,并加入500μL的EndoGRO培养基和补充物(包括血清和VEGF);将1.6 mL相同的培养基加入到包含插入物的孔中。将平板置于37℃、5% CO2的培养箱中。24小时后,使用EVOM2(世界精密仪器公司,美国)测量跨皮/内皮电阻(TEER)。在进行通透性实验之前,先用组胺和西咪替丁检测血脑屏障单层的敏感性。简单地说,培养基被替换,组胺被添加到最终浓度为50μM的插入物中。37℃孵育30分钟。36 h测定TEER值,用无菌PBS缓冲液清洗细胞,加入新鲜培养基。西咪替丁是在最后一次50μM时被添加到插入物中。孵育1 h,测量TEER值。将培养基替换为新鲜培养基,孵育12 h, 48 h后再次测定TEER值,并通过转移试验测定TEER值。所有的测量都进行了三次,同时计算了平均值和标准差(SD)。

 在转驱研究中,将hCMEC/D3细胞以90000个细胞/培养基接种48h,测量TEER值以确保生物屏障的形成。将培养基替换为新鲜培养基,将NPs添加到根尖侧,最终浓度为0.4 mg/mL。浓度(NPs BBB的单层评估通过测量荧光管基底室在λexc 270 nm和λems 341海里通过SpectraMax i3x多模检测板读者(美国分子设备)。

NPs在血脑屏障上的转运由公式1计算:

% 的 NPs 在 基本的 Chaner = <u>t时刻基腔内NP荧光</u> × 100

                                   方程1(1 eq)

式中“t时刻基腔内NP荧光”表示某一时刻基腔内NPs的荧光;“总NP的荧光”是指将所有NP样本加入基底外侧室时NPs的荧光。表观渗透率(Papp)按以前报道的方法计算。40

在24h时对基底外侧室内的NPs进行最终荧光测量后,再次测量TEER值,并将培养基替换为预热的新鲜培养基。在根尖侧加入fitc -右旋糖酐溶液(1mg/mL) 10μL,测定基底侧室的荧光(λexc 485 nm, λems 520 nm)。该实验被重复了三次。

2.2.13.统计分析

使用GraphPad Prism8.0.1版(Windows版) (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)进行单因素方差分析(ANOVA),然后进行Tukey 's事后多重比较检验,以确定处理组之间的统计显著性差异。统计学上,P<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

  3.1.表征纳米粒子的化学结构,尺寸分布和形态

  我们检测了三种两亲性肽(表1)。在这些化合物中检测了两种类型的脑靶向配体:MiniAp-3 (CKAPETALC)41和HAI peptide (HAIYPRH)42。此外,在MMP-9抑制剂肽的N端,三个甘氨酸残基被合并作为MMP-9抑制剂肽和胆固醇之间的间隔物。HPLC数据(补充信息S1和S2)表明肽1和肽2的半胱氨酸之间形成了二硫桥(图S1在保留时间为13.7和14.0 min时峰,图S2在保留时间为15.9和16.4 min时峰)。对于肽3,17.5 min时峰值(Supp. Figure S3)表明肽中半胱氨酸氨基酸之间形成了二硫化桥。这些观察结果表明,尽管没有采取任何有意的步骤来进行肽的环化,肽在从树脂中裂解后仍然进行了原位环化(但不完全)。LC/MS数据证实肽3的合成成功(图S4)。在这些多肽中,只有序列为GGGCTTHWGFTLCHAIYPRH的肽3与胆固醇成功偶联。另外两个肽段在Kaiser试验中未显示与CHF结合。因此,肽3的结果如下。LC/MS数据和紫外色谱图显示了CHF与肽序列的偶联(Supp.图S5和S6)。偶联肽3的计算质量为2626.13 Da;在1314.5处的m/z表示双荷电共轭肽3,在876.9处的m/z表示三荷电肽,在738.5处的m/z表示CHF裂解肽3。mmp -9抑制剂NPs的平均粒径为202.8±105.6 nm,多分散性指数(PdI)为0.2(图2),zeta电位为+26.7 mV。TEM图像显示MMP-9抑制剂NPs呈不规则形状(图3)。由于这是一项初步研究,我们预计只有偶联肽才能形成纳米颗粒,因此我们没有纯化偶联肽。

  3.2.MMP-9抑制研究

  图4A为MMP-9酶存在20小时后MMP-9可裂解肽(TY-26) NMR信号的典型变化,可以看出完整肽信号(-117.5 ppm)逐渐减少,出现降解产物信号(-117.2 ppm)。20 h后降解产物信号清晰可见,MMP-9可裂解肽的降解速率常数为4.5×10-6 s-1。另一方面,在MMP-9抑制剂NPs存在的情况下,TY-26的裂解被MMP-9酶完全阻断(图4B)。在重复运行中,我们发现在MMP-9酶和MMP-9抑制剂NPs的存在下,TY-26的裂解减少到1.9×10-6 s-1(补充图S7)。TY-26的解理变化可能是由于NPs中的杂质所致。在TNCB缓冲区存在的情况下,TY-26没有明显退化(图S8)。此外,MMP-9无反应肽(TY-27)在MMP-9存在时没有降解(图S9)。这些对照试验表明,在MMP-9酶存在的情况下,TY-26降解受到抑制,MMP-9抑制NPs。

  3.3.MMP-9抑制纳米颗粒的无毒作用

  图5显示了评估MMP- 9抑制NPs对LDH释放的潜在影响的实验结果。LDH释放增加表明细胞死亡增加。试验浓度的NPs没有诱导LDH的释放,与阴性浓度相比有显著差异。阴性对照组的LDH释放百分率为18.2±2.6%,而NPs在0.06 mg/mL、0.14 mg/mL和0.25 mg/mL时,分别为19.3±3.3%、19.3±4.7%和17.1±2.6%。单因素方差分析没有显示对照组细胞和处理细胞(所有浓度)之间LDH释放百分比的统计学差异(P=0.9)。

  3.4.MMP-9抑制纳米颗粒的透析体外崩解

  进行崩解(释放)研究,以确定抑制NPs的MMP-9是否会在稀释后(例如静脉注射后)降解。图6显示,NPs在40 mL蒸煮水中孵育6小时后,荧光强度从155.7±28.7 a.u轻微增加到235.2±33.9 a.u。典型的荧光曲线如图S10所示。这表明MMP-9抑制NPs的临界胶束(聚集)浓度远低于37 mg/L。然而,当MMP-9抑制NPs的释放介质与胎牛血清孵育24小时后,荧光强度显著从158.7±30.8 a.u增加到445.1±68.1 a.u。然而,降解过程分为两步。从图6中可以看出,在第一步中,在胎牛血清存在的情况下,5小时内荧光强度仅从158.7±30.8 a.u增加到218.9±27.9 a.u。在胎牛血清中孵育24小时后,荧光强度跃至445.1±68.1 a.u。这一观察结果表明,NPs是被血清中的酶降解的,而不是被稀释后的降解。此外,抑制NPs的MMP-9不会被血清酶迅速降解。

  3.5.MMP-9抑制纳米颗粒体外血脑屏障迁移的研究

  BBB的t值模型达到239±28Ωcm2 48 h后孵化;后略增至250±13Ωcm2MMP-9抑制NPs细胞的治疗。组胺治疗了t值从200Ωcm2 减少到62Ωcm2。而与西咪替丁治疗帮助TJ恢复其完整性145Ωcm2如图7所示。

  MMP-9抑制NPs显示穿过体外BBB的能力(图8)。NPs穿过BBB模型的比例达到23±5%经过两个小时的孵化和达到28±3% 5 h。然而,图8显示了减少,虽然不明显,NPs的数量(从顶端的BBB模型基底外侧5 h后,在24小时减少到22%±3%。这一趋势更明显Papp计算时(图9)。从图9可以看出Papp下降2 h后孵化后,表明没有轮回的净增长NPs在基底外侧隔间。Papp的负值显示了基底外侧腔室NPs总数量的净减少。这一观察提示一些NPs从模型的基底外侧返回到根尖侧。NPs处理细胞后,观察到只有0.5±0.1%的fitc -右旋糖酐通过体外血脑屏障模型,说明NPs不影响血脑屏障的通透性。

  4. 讨论

  这项工作证明了制备含有脑靶向配体的硬核肽基NPs,具有MMP-9抑制特性。NPs被证明是无毒的,平均直径为200nm。在基于19F NMR的检测中,NPs能够完全或一半地降低MMP-9酶的活性。重要的是,NPs在稀释后仍然保持其完整性,但可以被血清中的酶逐渐水解。此外,抑制NPs的MMP-9显示了通过体外血脑屏障模型的能力。在这项工作中,我们没有研究没有脑靶向配体的NPs的能力。这是基于其他研究者的观察得出的结论,即包括脑靶向配体可以显著提高NPs在静脉注射后穿越血脑屏障的能力43-47

  在之前的研究中,磁nps结合的TMP-1的大小为10±3 nm17,,同样表面吸附在量子点(QD-siRNA nanoplexes)上的siRNA直径为15-20 nm16。这些比我们在本研究中发现的MMP-9抑制NPs小得多,但是与之前的研究相比,我们的NPs呈现出不规则的形状16,17。本研究中磁性NPs17,和MMP-9抑制NPs的PdIs相似。在另一项研究中,封装TMP-1的PLGA NPs的直径在80nm到430 nm之间(取决于TMP-1的负载)18;PLGA NPs是球形的。此外,Cu@mSiO2-PEG NPs在HeLa细胞中表现出对MMP-9的抑制作用48。这些NPs的形状也不规则,但平均直径为179.7nm49。因此,我们研究的MMP-9抑制NPs的大小在之前的研究范围内。此外,这些相对较大的NPs有望使其驻留在脑屏障的基板上50,这将是有益的,因为位于脑屏障的MMP-9增加了脑屏障的通透性,从而导致神经元损伤51

  研究人员已经开发出降低MMP-9表达的配方。例如,Cu@mSiO2-PEG NPs降低了HeLa细胞48中MMP-9的表达,QDsiRNA nanoplexes降低了脑微血管内皮细胞中MMP-9表达78%。此外,包覆MMP-9的固体脂质nps下调shrna可使人角膜上皮细胞中MMP-9的分泌减少30%。52我们的NPs抑制MMP-9的能力是通过使用一种特殊设计和优化的基于19F NMR的分析来研究的,该分析测量MMP-9治疗后与对照组相比剩余的19F标记肽。本研究中抑制MMP-9的NPs浓度为480mol / l,可以完全或一半降低MMP-9的活性。NPs抑制MMP-9性能的变化可能是由于NPs中的杂质所致。因此,需要使用纯化的共轭肽进行进一步的实验来验证这一假设。CTTHWGFTLC肽对MMP-9的抑制作用IC50约为500 μM31

  因此,含CTTHWGFTLC肽的MMP-9抑制NPs在溶液中表现出与单独母肽相当的抑制活性。在另一项研究中,经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)稳定的金NPs在400μg/mL时完全阻断了MMP-9的活性53。在我们的MMP-9抑制研究中,金纳米颗粒的浓度明显低于抑制MMP-9的纳米颗粒浓度(1.25 mg/mL)。因此,金NPs对MMP-9的抑制比肽基MMP-9对NPs的抑制更有效。但值得注意的是,金NPs可以激活小胶质细胞54,而抑制mmp -9的NPs可以被体内的酶消化。

  在本研究中,MMP-9对NPs的抑制作用达到250μg/mL,对HeLa细胞没有明显的毒性,其他纳米颗粒制剂也有类似的结果17,52,53;而pdp包覆的铂NPs在100μg/mL的浓度下确实表现出了细胞毒性53。此外,磁性NPs结合的TMP-1 NPs在浓度超过氧化石墨烯10μg/mL时表现出细胞毒性17。这些观察结果表明,在我们的研究中,MMP-9抑制NPs,即使浓度高达(250 μg/mL),也不存在任何毒性问题。不同于以前报道的某些配方17,53。在这项工作中,我们评估了MMP-9抑制NPs在HeLa细胞(分裂和生长异常快)中的毒性,类似于之前的工作55。这主要是由于血清存在于hCMEC/D3培养基中,它可能消化MMP-9抑制肽,并掩盖NPs的毒性作用。然而,使用MMP-9抑制NPs后,血脑屏障模型的TEERs值并未下降。这也显示了NPs对hCMEC/D3细胞的无毒作用,因为已有研究表明,细胞毒性物质降低了体外血脑屏障模型的TEER值56。也许,毒性研究也可以在大脑内皮细胞和神经元细胞中进行16,17

  在纳米颗粒配方上面所讨论的,在上述讨论的纳米颗粒配方中,PVP稳定金NPs 53,CuS@mSiO2-PEG NPs48, 和MMP-9抑制NPs我们的工作不需要加载一个活性成分,如TIMP-116-18,52。因此,MMP-9抑制NPs在扩大我们的研究将会更少的挑战相比其他方法治疗脑部疾病,当干扰MMP-9增加大脑的活动。然而,值得注意的是,我们注意到胆固醇氯甲酸酯的共轭过程缓慢。因此,还需要进一步的研究来优化这一过程,甚至用合成更容易处理的疏水肽序列来替代胆固醇基序,从而通过这些两亲性肽在水介质中自组装形成NPs57-63;可提高规模。在这种方法中,需要使用圆二向色性进行研究,以确定肽二级结构在形成自组装纳米粒子中的作用64

  在这里,我们发现与Mini-app3 (CKAPETALC)相比,HAI peptide可以更有效地与mmp抑制肽(CTTHWGFTLC)结合。在以前的工作中,聚山梨酯80被用来促进NPs通过血脑屏障18。而在另一项工作中,使用了0.08 T的磁场,使磁性NPs通过血脑屏障的BBB17。脑靶向配体的使用不需要申请磁场。此外,聚山梨酯80的使用可能会在肺部积聚NPs19。然而,在我们的研究中,只有28%(最多)的MMP-9抑制NPs通过了体外血脑屏障,而在磁场的影响下,磁性NPs可以达到40%左右。值得注意的是,使用hCMEC/D3的体外血脑屏障模型可能不能代表生理血脑屏障。研究表明,该屏障对fitc -葡聚糖(mw70kda)是不可渗透的,但对较小分子量的fitc -葡聚糖(mw4kda)是可渗透的65。此外,我们工作中使用的血脑屏障模型缺乏血脑屏障的其他组成部分,如星形胶质细胞和周细胞,或者是动态的66-68。然而,通过使用静态的单层脑内皮细胞(如我们的模型),在体内和体外数据之间已经观察到良好的相关性64,69。最终,体内研究将进一步表明MMP-9抑制NPs穿过血脑屏障的能力。体内研究将考虑通过血脑屏障、与血浆蛋白结合、网状内皮系统的清除以及血清中的酶解70。在我们的研究中,MMP-9抑制NPs的作用在体外血脑屏障模型孵育2小时后出现交叉17。这与先前发表的作品一致。有人认为,在这一时期,部分NPs可能被网状内皮系统从血液中清除。体内研究表明,当3小时后,只有10%的外泌体通过BBB血脑屏障模型时,外泌体包裹的金纳米颗粒发生了显著的脑吸收69。这表明,当体外数据显示低水平的NPs穿过血脑屏障时,体内数据可能显示完全相反的情况。

  含胆固醇的两亲性肽自组装形成纳米颗粒,并测量临界胶束浓度(CMC)37。基于这一观察,我们推测我们研究的NPs是通过自组装形成的。然而,长时间的声波作用形成不规则形状的纳米颗粒,使两亲性肽能否在分子水平上分散在水介质中用于CMC测量产生了疑问。尽管这一性质创造了一个优势,即NPs不会在稀释后分解。

  MMP-9抑制NPs的可用性(如本研究所示)可用于缺血性脑卒中的治疗71。在之前的工作中,以聚乙二醇-b聚(D, L-丙交酯)共聚物,并加载姜黄素制备了高分子NPs。NPs的大小分布为147.8±5.7 nm。纳米载体未装饰有脑靶向配体,并将其静脉注射给缺血/再灌注损伤的小鼠。纳米载体出现在缺血/再灌注损伤的区域,降低了缺血皮质中MMP-9的表达,有助于减少梗死面积,改善功能恢复72。纳米载体可能通过缺血区受损的紧密连接穿过血脑屏障72。应该注意的是,在急性缺血性中风中,血脑屏障会迅速被破坏,并且这种破坏会持续数天73,74。人脑梗死区血脑屏障的通透性从0.83 mL/100 g /分钟增加到1.15 mL/100 g /分钟73。因此,BBB的渗透率提高了约38%。这仍然是一个强大的障碍,以允许足够的NPs跨越BBB。因此,如前文所示,当NPs表面装饰有脑靶向配体时,更多的NPs进入大脑,治疗效果明显改善75。这些观察结果表明,NPs的表面应饰以脑靶向配体,以达到治疗缺血性中风的显著/期望的临床效果。此外,高血糖患者血清中MMP-9水平升高,这使他们容易因血脑屏障受损而中风76。因此,安全的抑制NP形成的MMP-9对这些患者是有益的。

  先前的一项研究对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠腹腔注射0.5 mg/kg(12.43μg/家鼠)三螺旋MMP-9抑制肽;临床严重程度从第12天(诱导后)开始降低77。由于这些肽不含脑靶向配体,但显示出临床疗效,因此可能建议相似的剂量将适用于体内工作。然而,考虑到静脉给药的NP通常有1%到达脑,小鼠脑脊液体积为75和35μL,则MMP-9抑制脑内NP浓度为3.5 mg/mL,每只小鼠剂量为12.42μg。由于我们的体外数据显示,在1.25 mg/mL时MMP-9活性降低,那么在体内研究中,0.5 mg/kg的剂量可能足以抑制小鼠大脑中的MMP-9。这些计算是基于MMP-9抑制NPs会在体内通过血脑屏障的假设。

  这项研究也有局限性。首先,应在体内测试MMP-9抑制NPs,如先前报道的EAE小鼠中,大脑中MMP-9水平升高会导致神经退行性变77,78。这也将有助于测试蛋白冠对NPs抑制MMP-9的效果的影响。第二,在NPs结构中加入不同MMP-9抑制活性的肽,以测试MMP-9的抑制活性是否仅来源于MMP-9抑制肽。第三,应检测抑制NPs的MMP-9的血液相容性,如补体活化、溶血和血小板聚集。在这项工作中,我们没有研究我们的MMP-9抑制NPs对大脑中其他酶如MMP-2的潜在抑制作用77。因此,如果需要对MMP-9进行排他性抑制,就应该考虑到这一方面。

5. 结论

  我们的工作提出了开发基于肽的MMP-9抑制NPs的概念证明,能够显著降低MMP-9的活性。NPs包括脑靶向HAI肽配体,有助于通过体外血脑屏障模型。重要的是,NPs的细胞毒性在浓度达到250磅/毫升时没有表现出来。此外,与之前报道的用于脑药物传递的纳米颗粒制剂相比,这些制剂具有可扩展性和不需要装载活性成分的优点。此外,NPs的平均直径为202.8±105.6 nm, PdI为0.2,这使得NPs适合留在血脑屏障的基础层,在那里,内皮细胞或巨噬细胞释放的MMP-9活性会影响血脑屏障的通透性。我们设想,所述体外的概念可以作为一个平台新体外和体内研究发展的一个新类brain-targeting MMP-9抑制剂治疗进行性神经退行性疾病和脑损伤,当MMP-9不受欢迎的活动增加。

6. 感谢

  我们感谢奥利维亚·富兰克林、奥斯卡福·阿拉比和克洛伊·杰拉蒂提供的技术援助。

7. 对利益的承认

作者声明没有利益冲突。