当我还是个研究生的时候，我的PI问我每百万个细胞使用多少微升的特定抗体，我告诉他我的染色条件是 "每100微升 "而不是 "每百万细胞"。这引发了一场关于抗体量的激烈辩论--他认为所需的抗体量在很大程度上取决于细胞数量，而我认为根据染色量添加抗体比细胞数量更重要。说实话，我不记得那天的争论谁 "赢了"，但鉴于他有高超的辩论技巧，而我当时缺乏具体的证据，我可能没有说服他的错误。现在我已经在流式细胞仪核心设施工作了几年，我注意到围绕抗体浓度和细胞数量的问题经常出现，通常以 "我应该染色多少个细胞 "的形式出现。当研究人员有有限的细胞数量需要研究，或者他们试图扩大他们的染色方案以分选更多的细胞时，这个问题似乎最常被考虑。回想我与我的研究生院PI的辩论，我想知道研究人员如何理解细胞染色条件对他们的结果的影响，以便正确解释他们的结果。在这篇文章中，我将讨论细胞染色条件对结果的影响，以及如何应用这些概念来确定一个实验需要多少细胞。
影响细胞染色的因素
细胞染色过程中的许多因素会改变所产生的荧光团强度--包括孵化时间、孵化温度、细胞数、染色量和抗体浓度。在理想的情况下，所有的因素对所有的样品和对照都应该保持完全相同。现实上，这可能是一个挑战，有时这些因素会发生变化。那么，当你改变染色条件时会发生什么？在我提到的五个因素中，我将假设孵化时间和温度保持不变，因为这些是最容易保持不变的参数，因此应该始终保持不变。抗体浓度完全取决于染色量，所以我倾向于把这两个因素放在一起，总是用100μL进行染色。当然，对于大量的细胞，100μL可能不是最好的选择，但我将在后面讨论这个问题。既然知道在不同的试管和实验中保持孵化时间、孵化温度和染色量一致应该很容易，我们就剩下细胞数量和抗体浓度了。这两个因素可能是最难保持一致的，我想进一步详述改变这些因素对结果的影响。
抗体浓度
我现在要告诉你，抗体浓度是细胞染色方案中最重要的因素。如果抗体浓度发生变化，染色模式的差异可能是巨大的。正因为如此，我强烈建议对所有的抗体进行滴定，并制作一个所有抗体的主混合物来染色所有样品。滴定将确定使用的最佳抗体量，主混合物将确保所有样品得到相同数量的抗体并减少移液误差。为了获得可靠的结果，我不建议移液量少于2μL。如果需要小体积的抗体，请先对抗体进行稀释! 图1展示了抗体浓度如何影响阳性群体的分辨率。在图中，最佳分辨率是由最高的染色指数决定的。
由于抗体浓度非常关键，另一个提示是记录抗体的量，单位是mg/mL，而不是每体积的染色缓冲液的抗体量。这样做的原因是，如果一个特定的抗体克隆的荧光基团发生变化，可以简化滴定过程。如果我知道我在100μL中滴定了一个PE抗体为0.1μg，然后我决定将荧光基团换成FITC（相同的抗体克隆），那么我知道我很容易计算并使用100μL中的0.1μg，即使PE抗体的浓度为0.2 mg/mL，FITC抗体的浓度为0.5 mg/mL。如果我把我的抗体滴定记录为 "1:100 "或 "2μL"，那么在抗体上切换荧光团的工作就会更多。要明确的是，最好的做法是总是滴定每一个抗体，但是使用相同的mg/mL（或μg/100μL）往往是有效的，而且无论荧光团如何，滴定每个抗体克隆的方法比不滴定更好。
- 我查了一下，染色指数（SI）可用于比较不同荧光染料在流式细胞术应用中荧光亮度的差异。该值通过使用阳性区域的平均荧光强度 (MFI)减去阴性区域的平均荧光强度得到的差值,再除以两倍的阴性区域标准差获得。染色指数越大,荧光强度越高。进行抗体滴度的时候,根据染色指数来选择最佳的抗体用量。 https://denovosoftware.com/full-access/knowledge-base/stain-index/
Stain Index = (Median of Positive - Median of Negative) / (SD of Negative * 2)
细胞数
有些人可能会惊讶地发现，细胞数量对数据的影响很小。在下面的例子中，我用相同浓度的抗CD4抗体对100-1000万个细胞进行染色（图2）。除了细胞数量，其他所有的染色条件都保持不变。即使细胞数量增加10倍，也没有对阳性群体的频率或MFI产生明显影响。请注意，这可能不是对每个单一的抗体都是如此，因为有些抗体对细胞数量比其他抗体更敏感，但一般来说，细胞数量不像其他染色条件那样关键。在实践中，这意味着一个单一的抗体浓度可以对一系列的细胞浓度起作用。
抗体浓度和细胞数的应用
研究人员能从每个样本中获得多少细胞，以及感兴趣的最小群体有多稀有。当细胞数量有限时，研究人员需要更仔细地考虑用多少细胞做对照，以及改变细胞数量如何影响面板中每个标记物的染色。为了解决 "应该染色多少细胞 "的问题，我将把它分解成三个独立的不同问题。
1.实际样品应该有多少细胞被染色？
2.对照组应染色多少个细胞？
3.滴定抗体时应染色多少个细胞？
- 第一个问题很简单。默认情况下，我们建议对1×106个细胞进行染色。然而，总细胞的数量最好由感兴趣的最稀有的群体的频率决定。假设我们想检查一个含有50%中性粒细胞、10%单核细胞、30%淋巴细胞和0.5%调节性T细胞（Tregs）的血样。如果实验的重点是单核细胞作为最罕见的感兴趣的群体，我们不需要大量的细胞。知道单核细胞约占总细胞的10%，我们可以计算出收集5万个事件将得到约5000个单核细胞。如果样本不受限制，我建议对0.5×106-1×106个细胞进行染色。然而，如果样本有限，我可以计算出我可以染色1×105个细胞，仍然能够分析出适当数量的细胞。请记住，细胞在染色过程和通过细胞仪推送样品的过程中会丢失，所以不要染色1×105个细胞并期望能够准确地分析1×105个细胞!
现在让我们改变实验的重点--假设目标是检查Tregs。基于特雷格只占总细胞的0.5%这一知识，在总共5万个细胞中只能分析250个特雷格。建议在最罕见的群体中至少有100-500个事件，这取决于群体上的标志物有多明显。在这种情况下，总的5万个细胞有可能被用来分析Tregs，但更多的细胞肯定是个好主意。 - 关于对照组和滴定的第二个和第三个问题比较难回答，归结为有多少细胞可用。如果样品数量不受限制，那么应该用相同数量的细胞来染色对照和样品。如果样本量有限，那么可能会对对照组的细胞进行较少的染色，以使完全染色的样本中的细胞数量最大化。荧光减一（FMO）对照组也应考虑到样品中种群的丰富程度。如果需要对稀有的细胞群进行FMO，那么应该对样品和FMO对照进行相同数量的细胞染色和分析。如果标记物在门控树上的位置较高，因此用于较大比例的细胞，则可能通过染色较少的细胞来获得--假设用较低浓度的细胞达到相同的染色强度。如果难以获得足够的样本和对照组的细胞，一个解决办法是确定是否可以用补偿珠来代替单个染色细胞。然而，补偿珠并不总是和细胞一样好，而且细胞总是需要用于FMO对照。
如果确定与样品相比，可以用较少的细胞做对照，则应考虑染色条件。很多时候，一个浓度的抗体可以用于一系列的细胞浓度，所以相同的抗体量和染色量可能是可以接受的。然而，如果样品和对照组的细胞数量有很大的差异，或者抗体对细胞数量特别敏感，那么如果抗体浓度和细胞浓度相同，可以取得更好的结果。例如，如果对照组是用0.25×106个细胞和1μL的抗体在100μL中进行染色，我们可以通过在2mL中染色5×106个细胞和20μL的抗体来保持抗体和细胞的浓度相同。然而，20μL是一个很大的抗体，所以考虑用10μL的抗体在1mL中染色5×106个细胞，或者甚至用5μL的抗体在0.5mL中染色，当然更便宜。重要的是保持抗体浓度完全相同，然后保持对照组和样本之间的细胞浓度相似，要知道一系列的细胞浓度对单一的抗体浓度也是有效的。当放大一个染色方案时，最好的做法是在同一个实验中对两个试管--正常和放大的细胞数量进行染色，并确定染色模式是否具有可比性。
细胞数量成为关键讨论点的另一个常见情况是从台式分析仪过渡到分选实验。例如，在台式分析仪上分析了1×106个细胞并发现一个非常有趣的群体后，下一步可能是对该群体进行分选。但是为了获得足够的细胞用于实验，假设根据已知的有趣群体的频率和分选后实验所需的细胞数，需要10×106个细胞。染色方案的规模与我上面描述的类似，用于分选实验。染色十倍的细胞需要十倍的抗体，这是不可能的 我通常假设滴定的抗体对5×106个细胞有效，所以作为一个例子，我建议将原来100ml 中0.1mg的抗体和1×106个细胞的条件扩大到200ml中0.2mg的抗体和10×106个细胞。 然而，这只是一种概括，以这种方式扩大染色方案可能不会对每种抗体和每种细胞类型都有效。最好的方法是进行测试并与原始方案进行比较。
任何好的科学实验的关键是一致性--使用相同的试剂、方案和仪器，真实的结果将是可重复的。但有些时候，科学家并不能像他们希望的那样保持一致。正如我所讨论的，可能没有足够的细胞用于所有的控制，或者试剂的成本可能成为一个限制性因素。在这些情况下，一个好的流式细胞测量师会了解他们的染色方案，以及如何在不影响结果的情况下改变细胞浓度和染色条件。一个好的研究生会用可靠的数据证明他们的PI是错误的。(我可能晚了几年，他可能不会看到这篇文章，但我认为 "我告诉你 "是有必要的！)
