转录组练习(3)

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作业要求

需要用安装好的sratoolkit把sra文件转换为fastq格式的测序文件,并且用fastqc软件测试测序文件的质量!

作业,理解测序reads,GC含量,质量值,接头,index,fastqc的全部报告,搜索中文教程,并发在论坛上面。

来源于生信技能树:http://www.biotrainee.com/forum.php?mod=viewthread&tid=1750#lastpost

实验步骤

1. 将 sra 数据转化成 fastq 格式(先把所有的sra放到一个文件夹里,姑且命名为SRR,然后 cd ~/SRR进入这个文件夹)

for i in {56..62}

do

fastq-dump --gzip --split-3-O /Users/chengkai/Desktop/zhuanlu_files -A SRR35899${i}.sra

done

--gzip 压缩格式为gzip

--split-3 如果是双端测序输出两个文件,如果不是只输出一个文件

-0 输出文件路径

“/Users/chengkai/Desktop/zhuanlu_files” 这里改成你自己的文件路径

-A 输入文件路径


搞定之后,会生成两个文件,列举其中一个 SRR3589956.sra_1.fastq.gz

然后所有的文件再放入另外一个文件夹(姑且命名SRA),然后在cd ~/SRA进入这个文件夹里面

for i in `seq 56 62`

> do

> fastqc SRR35899${i}.sra_1.fastq.gz

> done

或者 fastqc SRR35899${i}.sra_1.fastq.gz


质量解读

html 格式用浏览器打开

基本信息

Enconding: 测序平台版本号

Total Sequence: reads 的数量

Sequence length: 总的序列数

%GC GC比,这个指标有物种意义,用于区别物种,一般人类42%

image.png

每个read各位置碱基的测序质量

横轴碱基的位置(1-51),纵轴是质量分数,20表示1%的错误率,30表示0.1%

红色线代表中位数,蓝色代表平均数,黄色是25%-75%区间,触须是10%-90%区间

Warning 报警 如果任何碱基质量低于10,或者是任何中位数低于25

Failure 报错 如果任何碱基质量低于5,或者是任何中位数低于20

image.png

偏离度

横轴碱基的位置(1-51)

纵轴是tail的Index编号

检查reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度,蓝色代表偏离度小,质量好,越红代表偏离度越大,质量越差。

这个图主要是为了防止,在测序过程中,某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低

image.png

reads质量的分布

横轴表示Q值,0-40

纵轴是每个值对应的reads数目

当峰值小于27时,警告;当峰值小于20时,fail。我的报告峰值在38

image.png

GC 含量统计

横轴碱基的位置(1-51)

纵轴是碱基含量百分比

图中四条线代表A T C G在每个位置平均含量

当部分位置碱基的比例出现bias时,即四条线在某些位置纷乱交织,往往提示我们有overrepresented sequence的污染。

本结果前10个位置,每种碱基频率有明显的差别,说明有污染。

当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%,报"WARN";当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%,报"FAIL"

image.png

序列平均GC含量分布图

横轴是百分比; 纵轴是每条序列GC含量对应的数量

蓝色的线是程序根据经验分布给出的理论值,红色是真实值,两个应该比较接近才比较好

当红色的线出现双峰,基本肯定是混入了其他物种的DNA序列

偏离理论分布的reads超过15%时,报"WARN";偏离理论分布的reads超过30%时,报"FAIL"

image.png

各位置N的reads比率

当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时,就会产生“N”,统计N的比率

正常情况下,N值非常小

当任意位置的N的比例超过5%,报"WARN";当任意位置的N的比例超过20%,报"FAIL"

image.png

reads 长度分布

每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的

当reads长度不一致时报"WARN";当有长度为0的read时报“FAIL”

当测序的长度不同时,如果很严重,则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信

image.png

统计不同拷贝数的reads的频率

横坐标是duplication的次数,纵坐标是duplicated reads的数目,以unique reads的总数作为100%

测序深度越高,越容易产生一定程度的duplication,这是正常的现象,但如果duplication的程度很高,就提示我们可能有bias的存在

当非unique的reads占总数的比例大于20%时,报"WARN";当非unique的reads占总数的比例大于50%时,报"FAIL"

image.png

image.png

接头含量

此图衡量的是序列中两端adapter的情况

如果在当时fastqc分析的时候-a选项没有内容,则默认使用图例中的四种通用adapter序列进行统计

本例中adapter都已经去除,如果有adapter序列没有去除干净的情况,在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头

image.png

重复短序列

这个图统计的是,在序列中某些特征的短序列重复出现的次数

我们可以看到1-8bp的时候图例中的几种短序列都出现了非常多的次数,一般来说,出现这种情况,要么是adapter没有去除干净,而又没有使用-a参数;要么就是序列本身可能重复度比较高,如建库PCR的时候出现了bias

对于这种情况,我的办法是可以cut掉前面的一些长度,可以试着cut 1bp

image.png

参考文献

http://fbb84b26.wiz03.com/share/s/3XK4IC0cm4CL22pU-r1HPcQQ2irG2836uQYm2iZAyh1Zwf3_(青山屋主)

www.biotrainee.com/thread-2034-1-1.html(laofuzi)

http://www.jianshu.com/p/14fd4de54402(lxmic)

https://zhuanlan.zhihu.com/p/20731723(孟浩巍)

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