hello，大家好，今天我们要继续分享一些单细胞空间在医学研究中的运用，参考文章在Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer，2021年9月发表与杂志cell，顶级期刊，非常要借鉴价值，用到了非常多之前介绍的方法，包括单细胞技术，DSP空间技术，RNAscope等时下最热门的生物学技术，也有很多经典的分析方法，我们边分享，边给大家总结。

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需要注意的分析点

• 基于邻域中不同细胞的重复共定位的细胞相互作用网络
• 细胞类型的基因表达程序
• 细胞相互作用网络
• NMF 对基因程序的从头识别,转录程序的相似性，转录程序的共表达
• 免疫细胞与组织肿瘤细胞的定位问题
• 目标细胞生态位（这个强调过很多次了）
• PAGA分析cluster之间的相似性
• 细胞邻域分析

In brief

Single-cell transcriptomics-based covariation analysis of human colorectal cancer identifies a spatially resolved myeloid-rich inflammatory hub that is shared by mismatch repair-deficient (MMRd) and mismatch repair-proficient (MMRp) tumors and CXCR3-ligand+ multicellular foci distinct for MMRd tumors.

SUMMARY

对癌症的免疫反应是高度可变的，mismatch repair-deficient (MMRd) 肿瘤比mismatch repair-proficient(MMRp) 肿瘤表现出更多的抗肿瘤免疫力。为了理解控制这些不同反应的规则，转录分析了来自 28 个 MMRp 和 34 个 MMRd 个体的结直肠肿瘤和邻近正常组织的 371,223 个细胞。对 88 个细胞亚群及其 204 个相关基因表达程序的分析揭示了跨肿瘤的广泛转录和空间重塑。为了发现相互作用的恶性细胞和免疫细胞的hub，分析确定了不同细胞类型中的表达程序，这些细胞类型在受影响个体的肿瘤中共变，并使用空间分析来定位协调程序。在肿瘤-管腔界面处发现了一个与组织损伤相关的髓样细胞吸引hub和肿瘤内富含 MMRd 的免疫hub，激活的 T 细胞与表达 T 细胞与吸引趋化因子的恶性细胞和髓样细胞一起。通过识别相互作用的细胞程序，揭示了空间组织的免疫恶性细胞网络的潜在逻辑。

INTRODUCTION

几乎所有的肿瘤都被免疫细胞浸润，但不同癌症和个体肿瘤之间的免疫反应类型及其对肿瘤生长、转移和死亡的影响差异很大。 相互作用受到调节，并且它们在肿瘤内的空间组织方式仍然知之甚少。
结直肠肿瘤显示出很大的免疫反应动态范围，两种基因不同的亚型之间存在显著差异：mismatch repair-deficient (MMRd) 结直肠肿瘤具有高突变负荷，通常含有毒性 T 细胞浸润，并且对免疫检查点封锁有 ~50% 的反应率，而mismatch repair-proficient (MMRp) 肿瘤具有低突变负荷并且在很大程度上对免疫疗法无反应。
bulk肿瘤或单细胞的转录谱已被用于将结直肠癌 (CRC) 分类为亚型，定义它们的细胞组成，并根据受体-配体对的表达推断细胞类型之间的相互作用网络。 然而，这些研究集中在离散的细胞cluster上，并没有捕捉到转录程序的全部范围，这些转录程序可以作为cluster内或跨cluster的程序活动的连续梯度存在。 最近，基于成像的研究强调了基于邻域中不同细胞的重复共定位的细胞相互作用网络。 然而，这些研究受到预选标记数量的限制，这些标记可以解析关键细胞类型，但不能解析其更精细的特征。
在这里，作者开发了一种基于单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 谱的系统方法来发现细胞类型、它们的基础程序和细胞cluster，并将其应用于研究人类 MMRd 和 MMRp CRC 的区别特征。在免疫细胞、基质细胞和恶性细胞中鉴定了 88 个细胞亚群，以及 204 个相关的基因表达程序。揭示了基于个体肿瘤不同细胞亚群中基因程序活动共变的多细胞相互作用网络，并对预测的细胞亚群和程序的关键分子进行了成像，以在受影响个体的匹配组织中定位这些相互作用网络。分析发现基质重塑导致 MMRd 肿瘤中产生骨形态发生蛋白 (BMP) 的成纤维细胞减少，以及整个肿瘤中成纤维细胞衍生的干细胞生态位因子的错误定位。在原发性 MMRd 和 MMRp 肿瘤的管腔边缘发现了恶性细胞、单核细胞、成纤维细胞和中性粒细胞的炎症相互作用网络，以及 MMRd 特异性免疫活性热点，包括与活化 T 细胞相邻的表达趋化因子的恶性和非恶性细胞。研究展示了一条发现多细胞相互作用网络的途径，这些网络是人类癌症免疫和致瘤过程的基础。

RESULTS

A comprehensive atlas of cell subsets, programs, and multicellular interaction networks in MMRd and MMRp CRC（MMRd 和 MMRp CRC 中细胞亚群、程序和多细胞相互作用网络的综合图谱 ）

为了发现恶性、免疫和基质细胞如何在 MMRd 和 MMRp CRC 中相互作用，分析了来自 34 个 MMRd 和 28 个 MMRp 个体（另外收集了 2 个个体的lesion）以及邻近的正常结肠组织的 36 个未治疗的原发性肿瘤样本。 对分离的新鲜组织进行了基于液滴的 scRNA-seq，保留了 371,223 个高质量细胞，包括 168,672 个上皮细胞（非恶性和恶性）、187,094 个免疫细胞和 15,457 个基质细胞。

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• 注：MMR status and clinical characteristics of primary untreated individuals with CRC.

  
  
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• 注：(A) Number of cells in immune (T/NK/ILC, B, Plasma, Mast, Myeloid), stromal (Endothelial cells, Pericytes, Fibroblasts, Smooth Muscle cells, Schwann cells), and epithelial (malignant in tumor and non-malignant in normal specimens) compartment per specimen.(B) Number of cells per cluster (left) and fraction of cells from MMRd, MMRp, and normal specimens (right) within each cluster. Each specimen is indicated by a different color shade and separated by a vertical black line.

通过两步图聚类方法定义了细胞subset和转录程序。首先，将所有细胞分为 7 个主要部分（T/自然杀伤 [NK]/先天淋巴细胞 [ILC]、B、血浆、肥大、髓细胞、基质/内皮细胞和上皮细胞）。其次，在每个分区内，我们使用一致非负矩阵分解（NMF）推导出cluster（prefix“c”）和转录程序（具有共变表达的基因组，prefix“p”）。细胞cluster和基因程序彼此独立编号。 NMF 对程序的从头识别实现了多项关键分析：(1) 同时识别跨多种细胞类型（例如增殖、代谢和免疫程序）共享的程序，特定于细胞类型（例如浆细胞样树突细胞 [pDC]程序），和/或以簇内或簇间的连续梯度表示； (2) 尽管存在强烈的个体特异性转录状态，但发现个体间恶性细胞共有的生物学特性； (3) 识别跨多个肿瘤的共变程序，以找到反映细胞相互作用或对共同触发因素的反应的协调细胞或状态网络。

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• 注：(B) tSNEs (t-distributed stochastic neighbor embedding) by major cell partitions (left), tissue type (middle), or specimen (right). (C) NMF-based gene programs can be cell type specific (example 1, pS02-Fibro matrix/stem cell niche) or shared (example 2, pTNI03-proliferation; example 3, pEpi30-ISGs).

Remodeling of the immune cell compartment in MMRd and MMRp CRC（免疫细胞compartment的重构 ）

为了了解 CRC 中差异免疫反应的基础，首先比较了 MMRd 和 MMRp CRC 与正常结肠组织的免疫组成，发现肿瘤和正常组织之间以及 MMRd 和 MMRp 肿瘤之间发生了显著的重塑。 具体而言，作为肿瘤（MMRd 或 MMRp）和正常结肠组织之间所有免疫细胞的一部分，43 个免疫细胞cluster中有 37 个differentially abundant。 肿瘤耗尽了产生免疫球蛋白 A (IgA) 的浆细胞、B 细胞、IL7R+ T 细胞和 gd 样 T 细胞，并富含调节性 T 细胞 (Treg)、单核细胞、巨噬细胞和相对于正常结肠可能的中性粒细胞

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• 注：Compositional changes in immune cell clusters in MMRpandMMRd tumors relative to adjacent normal tissue. Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 for MMRp versus MMRd are marked with asterisks.

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• 注：(A) Heatmaps showing selected unbiased and well-established marker genes for immune clusters as mean expression in normalized log2(TP10K+1). Clusters with differences in frequency between MMRp and MMRd tumors with Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 are marked with *. A comprehensive list of DEGs for each cluster can be found in Table S2. (B) Changes in immune cell clusters in MMRp and MMRd tumors relative to adjacent normal tissue, showing frequency of immune cells (dot size) and enrichment/depletion (Pearson residual, colored squares). Clusters with differences in frequency between MMRp and MMRd tumors with Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 are marked with *.

肿瘤中单核细胞/巨噬细胞显著扩增。 单核细胞和巨噬细胞上调肿瘤特异性 NMF 衍生的转录程序，其特征在于可以放大炎症的基因（pM02 中的 MMP12 和 MMP9）、募集骨髓细胞（pM10 中的趋化因子 CCL2 和 CCL7）、刺激生长（pM14 中的生长因子 VEGFA 和 EREG ），并解决炎症（APOEin pM06）。 来自 MMRd 肿瘤的骨髓细胞显示出更高的糖酵解基因程序活性 (pM03)、免疫激活警报蛋白如 S100A8/9/12 (pM16) 和吸引单核细胞和中性粒细胞的趋化因子 (pM20)。 总体而言，单核细胞和巨噬细胞在肿瘤中进行了重塑，并在 MMRd 肿瘤中表达了更多的免疫激活程序。

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• 注：(B) tSNEs of myeloid cells in all normal and tumor samples. (C) Activities of selected myeloid gene programs with high activities in monocytes and macrophages. Each dot indicates the 75th percentile of the program activity in the myeloid cells of one specimen. GLME (generalized linear mixed model) FDR: **** %0.0001, *** %0.001, ** %0.01, * %0.05, not significant (ns) for > 0.05. tSNEs below show program activities within the myeloid compartment. For each program, the top genes are listed below, with circle size indicating the relative weight of each gene within the program.

T cell compartment differences between MMRd and MMRp tumors

MMRd 与 MMRp 肿瘤的免疫组成的主要变化发生在 T 细胞compartment中。 在 MMRd 肿瘤中富集的cluster中有 CXCL13+ T 细胞和 PDCD1+ gd 样 T 细胞，而 IL17+ T 细胞在 MMRp 肿瘤中富集。 T 细胞中的 CXCL13 在其他 CRC 和黑色素瘤单细胞研究中已被注意到，并且最近已成为人类肿瘤反应性 CD8+ T 细胞和免疫治疗反应的标志物。因此，假设抗肿瘤 T 细胞免疫可能在 MMRd 中经常发生，但在 MMRp 肿瘤中很少发生.

富含 MMRd 与 MMRp T 细胞的程序包括两个程序（pTNI18 与 CXCL13、PDCD1、TOX；pTNI06 与主要组织相容性复合体 [MHC] II 类、IFNG 和 LAG3）在 T 细胞受体 [TCR] αβ- 和 TCR γσ- 样 T 细胞中具有高和中等活性细胞，以及 CD8+、γσ-样、PLZF+ (ZBTB16) T 细胞和 NK 细胞共享的一种细胞毒性程序 (pTNI16)。 PLZF+ T 细胞和 NK/ILC3 细胞被先天 T 细胞程序 (pTNI08) 选择性标记，与正常组织相比，该程序在 MMRd 和 MMRp 肿瘤中减少。 在三个外部 CRC 队列中证实了 CXCL13 和细胞毒性程序（仅可归因于 T/NK/ILC 分区，使我们能够分析大量数据）的更高 MMRd 活性。 因此，在 MMRd 肿瘤中，T 和 NK 细胞亚群获得细胞溶解特性（GNLY、GZMB 和 PRF1），并且 T 细胞获得与慢性刺激相关的耗竭标志物（例如，PDCD1、TOX、LAG3 和 HAVCR2）。

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CXCL13+ T cells localize within MMRd tumors

鉴于 CXCL13+ T 细胞在 MMRd 肿瘤中的富集及其先前与免疫治疗反应的关联以及肺癌中三级淋巴结构 (TLS) 的定位，用靶向 CXCL13 和 CD3E 的 RNA 探针对队列中的组织切片进行了染色。 在整个 MMRd 肿瘤中发现了丰富的 CXCL13+ T 细胞，TLS 之外，通常在侵袭性边界处发现。 TLS 相关的 CXCL13 主要存在于网状模式的非 T（CD3E 阴性）细胞中，这与基质和滤泡树突细胞作为 TLS 中 CXCL13 来源的报道一致。 表达 CXCL13 的常规 CD4+ 和 CD8+ T 细胞位于淋巴结构之外，但靠近癌细胞，与effector activity一致。

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• 注：Localization of CXCL13+ T cells in tumor center versus lymphoid structure. Left: H&E. Right: CD3E and CXCL13 RNA in situ hybridization (ISH). Scalebar, 200 mm.

Highly altered endothelial cells in MMRd and MMRp tumors

基质compartment在两种肿瘤类型中都被重塑，内皮细胞和周细胞作为基质细胞的一部分增加，而淋巴管内皮细胞作为肿瘤内皮细胞与正常细胞的一部分相比减少。除了肿瘤和正常细胞之间共享的一个cluster外，还发现了 8 个肿瘤特异性内皮细胞cluster，在MMRd 和 MMRp 肿瘤之间没有显著差异。量化肿瘤内皮细胞cluster与正常结肠细胞之间的相似性（使用基于分区的图形抽象 [PAGA]），发现了动脉和静脉细胞的改变版本以及几个未映射回正常细胞的cluster，例如尖端细胞和增殖细胞。有趣的是，这些增殖的内皮细胞表达 HIF1A 和 CSF3，表明存在代谢和炎症变化。具有基底膜胶原蛋白、促血管生成分子和尖端细胞标记物的 pS10 程序在所有肿瘤特异性cluster中上调，而干扰素刺激基因 (ISG)/抗原呈递 (pS05) 程序被抑制，如前所述。因此，内皮细胞在肿瘤中高度改变，具有更多的血管生成程序活性和免疫相关基因表达的变化。

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Inflammatory fibroblasts localize to the luminal surface of tumors

成纤维细胞分为 11 个subgroup，其中 6 个在肿瘤中占优势，5 个在正常结肠样本中。 与之前描述的肌成纤维细胞癌症相关成纤维细胞类似，3 个癌症相关成纤维细胞亚群 (cS26-cS28)（和肿瘤周细胞）表达了一种收缩程序（pS03），其中包括平滑肌肌动蛋白（ACTA2），其中一个亚群（cS26，肌成纤维细胞）与平滑肌程序（pS01）一起高度表达，与平滑肌细胞和周细胞共享。

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• 注：Selected programs in fibroblast and pericyte subtypes shown as in (D). Shown below are PAGA-based connectivity weights > 0.25.

  
  
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• 注Activities of pS03 (ACTA2), pS13 (inflammation), and pS17 (BMP fibro) in fibroblasts and pS03 and pS13 in pericytes, shown as in (E)。

两个癌症相关成纤维细胞 (CAF) 亚群（cS28 和 cS29）在两种肿瘤类型中都表达了炎症程序 (pS13)，在 MMRd 肿瘤中具有更高的活性。 该程序反映了之前描述的炎症性 CAF 和炎症性肠病中的炎症性成纤维细胞，包括组织重塑因子（MMP1 和 MMP3）和中性粒细胞吸引趋化因子（CXCL8 和 CXCL1）。 8 个 CRC 标本（4 个 MMRd 和 4 个 MMRp）中 MMP3 和无处不在的成纤维细胞标志物 COL1A1 的组织染色显示，这些高度炎症的成纤维细胞在 MMRd 和 MMRp 肿瘤的结肠腔边缘（LM）扩张血管周围显著富集。

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BMP-expressing CAFs are reduced in MMRd CRC, whereas CAF-derived stem cell niche factors are abnormally present throughout tumors

为了进一步了解 CAF 的功能改变，基于共享程序和基于 PAGA 的cluster之间的相似性，将 CAF 与来自正常结肠组织的成纤维细胞进行了比较 。鉴定了表达 BMP 的成纤维细胞 (c23、c24) 的 CAF 等效物 (cS27)，这些细胞排列在正常结肠上皮细胞中，并通过 BMP 和 Wnt 拮抗剂（如 FRZB）抑制 Wnt 来驱动上皮细胞分化。 这些可能对应于小肠中 PDGFRA 高的端细胞亚群。 通过 CXCL14 表达将表达 BMP 的 CAF 与其他 CAF subset区分开来。CXCL14+ 成纤维细胞排列在正常组织和肿瘤的上皮细胞中。先前的bulk RNA-seq 研究报告了 MMRd 与 MMRp CRC 中 CXCL14 的表达降低，但表明这是由于恶性上皮细胞中的差异表达。 尽管 MMRd 与 MMRp 恶性细胞中的 CXCL14 表达显著但适度（减少 ~1.25 倍），但 CXCL14 在恶性细胞中很少表达（~9.2% 的 MMRp 和 1.5% 的 MMRd 恶性细胞），只有一个例外（ MMRp个体C103）。

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• 注：(J) Quantification of CXCL14+, GREM1+, and MMP3+ CAFs among COL1A1/COL1A2+ fibroblasts based on whole-slide scans of 5 MMRd and 4 MMRp CRC specimens from (I); Mann-Whitney-Wilcoxon test. Rightmost graph: MMP3+ cells among all COL1A1/COL1A2+ cells outside or inside of the LM (defined as % 360 mm from the luminal border of the tumor); Wilcoxon matched-pairs signed rank test. Only 8 samples are included on the right because one clinical paraffin block did not contain LM. (K) Gene signature scores of top differentially expressed genes from CXCL14+ CAFs, GREM1+ CAFs, MMP3+ CAFs, and all fibroblasts in bulk RNA-seq from TCGA-CRC (COADREAD). Mann-Whitney-Wilcoxon test: ****p %0.0001, ***p %0.001, **p %0.01, *p %0.05, ns for > 0.05.

CAF 还有助于干细胞生态位因子的表达，例如 RSPO3 和 GREM1，它们在整个肿瘤中广泛表达，而它们在正常组织中的隐窝相关表达较低。 具体而言，在非肿瘤组织中，RSPO3 和 GREM1 的表达受到严格限制到隐窝底部以下的区域，最突出的是沿着类似于粘膜肌层的分布。相比之下，GREM1+ 和 RSPO3+ 细胞出现在从基底向上延伸到肿瘤体的基质带中。在 MMRd 标本中，这些细胞也占据与表达 CXCL14+ BMP 的成纤维细胞的上皮细胞相似的位置。 RSPO3 的高表达可驱动肿瘤生长，并且可能由一小部分人 CRC 中的 PTPRK-RSPO3 融合事件引起。分析的数据表明，增加获得干细胞生态位因子（如 RSPO3）的更常见机制可能是通过基质细胞和/或其程序（尤其是 CAF）的空间重新分布发生的。

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Malignant cells are actively engaged in the immune response

由于恶性细胞通常按个体分组（与按细胞亚群聚集的正常上皮细胞相反），识别它们的共同特性可能更具挑战性。 因此，我们推导出并分析了恶性细胞中 43 个表达程序的活动，这些程序并非特定于单个个体。 我们还根据与正常结肠上皮细胞亚型的相似性对恶性细胞进行了分类，以更好地了解它们的功能特性。
许多程序在恶性和正常上皮细胞之间具有不同的活性。 例如，与正常上皮细胞相比，恶性上皮细胞的成熟肠上皮细胞程序减少，增殖程序增加，这与绝大多数恶性细胞被归类为干/转运扩增 (TA) 样细胞一致。 在差异活跃的程序中，与 MMRp 相比，有 10 个在 MMRd 中的活性更高，6 个更低，在 3 个外部数据集中验证了这一发现，以及我们的队列和癌症基因组图谱 (TCGA) 中的类似程序分组。
特别是，3 个免疫相关程序显示 MMRd 和 MMRp 恶性细胞之间的活性升高：ISG（包括干扰素 γ targets）和 MHC II 类基因程序（pEpi34）在 MMRd 中比 MMRp 肿瘤更活跃（3.4 倍），ISG （I 型干扰素靶点）和 MHC I 类基因程序（pEpi30）在 MMRd 与 MMRp 相比轻度升高（1.6 倍，在正常上皮细胞中也有一些活性），以及中性粒细胞和免疫吸引趋化因子程序（CXCL1、CXCL2 、CXCL3 和 CCL20) (pEpi06) 在 MMRd 与 MMRp 肿瘤（1.6 倍）和两种肿瘤类型中均高于正常细胞。 因此，恶性细胞，尤其是在 MMRd 肿瘤中，表达可能介导与免疫系统相互作用的免疫相关程序。

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Co-variation of program activities across individuals predicts multicellular immune hubs

接下来假设一种细胞类型中基因程序的一些变化可能与另一种细胞类型的变化有关，要么是因为一种细胞类型对另一种细胞类型的直接影响，要么是因为共同影响两种细胞类型的共享信号或邻域
为了找到这样的多细胞协调程序网络，搜索了与受影响个体样本相关的程序活动（以下称为共变程序），分别分析 MMRd 和 MMRp 以更好地捕捉两种免疫学不同的肿瘤类型之间的差异。 使用 22 个髓系、21 个 T/NK/ILC 细胞基因程序和 MMRd 或 MMRp 衍生的恶性上皮程序（pEpiTd 和 pEpiTp）计算了每组样本中程序活动的成对相关性。 不包括基质细胞，因为每个样品的基质细胞数量不足以进行共变分析。 最后，我们使用基于图的程序聚类来识别 MMRd 中的 7 个共变多细胞hubs和 MMRp 样本中的 9 个。 这些hubs由跨细胞类型表达的多个程序组成，揭示了多细胞相互作用网络
为了识别彼此相似的程序，因此更有可能由共同机制触发，计算了程序之间top基因的重叠。 该分析揭示了不同细胞类型的免疫、代谢和其他程序相似。 分析注意到共变程序不需要彼此相似（尽管它们可以）并且通常以不同的top基因集为特征。
为了研究恶性细胞和免疫细胞之间的相互作用，我们关注了 2 个 MMRd 衍生的多细胞hubs（hubs 3 和 6），其中在免疫细胞中活跃的程序与在恶性细胞中活跃的免疫相关程序共变。

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Malignant cells, fibroblasts, monocytes, and neutrophils engage in inflammatory responses at the luminal surface of primary MMRd and MMRp tumors（恶性细胞、成纤维细胞、单核细胞和中性粒细胞在原发性 MMRd 和 MMRp 肿瘤的管腔表面参与炎症反应 ）

Hub 3 的特点是恶性细胞和单核细胞中的炎症程序与中性粒细胞程序共变，与正常组织相比，所有这些程序在 MMRd 和 MMRp 肿瘤中都高度活跃。 在hub也发现了 Treg 和 IL17 T 细胞程序。 Hub 3 在 MMRp 样本中很活跃，它的程序及其相关性在外部单细胞队列中被概括。 基于炎性骨髓、间质和恶性程序的相似性，显示重叠基因和共享转录因子预测，如核因子 kB (NF-κB) 和 CEPBP，还包括间质程序 pS13（在 GREM1+ 和 MMP3+ CAF 中活跃) 在我们对hub 3 的分析中。
为了了解驱动这些恶性/免疫/基质细胞相互作用的通讯途径，检查了在炎症和共变中性粒细胞程序的top基因中发现的所有趋化因子和细胞因子。 该分析表明，恶性细胞、GREM1+ 和 MMP3+ CAF、单核细胞和表达同源趋化因子 (CXCL1/2/3/5/6/8) 的中性粒细胞协同吸引 CXCR1/2+ 中性粒细胞。 在体外用hub 3 炎症单核细胞和中性粒细胞程序中发现的细胞因子刺激时，CRC 衍生的成纤维细胞和 CRC 恶性细胞中相同的趋化因子，如 IL1B。因此，恶性细胞、CAF、单核细胞和中性粒细胞似乎协同工作募集骨髓细胞并通过炎性细胞因子放大骨髓细胞的募集。
为了在肿瘤组织中定位这个炎症hub，对 MMRd 和 MMRp 标本进行染色，以获得中性粒细胞、骨髓细胞和恶性上皮细胞的标志物以及 IL1B 和 CXCL1 转录物。 8 个检查的样本中有 7 个显示在恶性细胞与结肠腔的界面处，尤其是在大量坏死的部位，中性粒细胞以及 IL1B+ 和 CXCL1+ 细胞显著积聚。尽管在恶性细胞和骨髓细胞中观察到了 CXCL1，但在既不是骨髓细胞也不是上皮细胞的细胞中存在强烈的 CXCL1 信号。尽管这些细胞很可能是 MMP3+ CAF，因为它们通过 scRNA-seq 表达最高水平的 CXCL1，并且主要在管腔表面发现，但需要进一步的成像研究来证实这一预测。鉴于该炎症hub的细胞和分子定位以及管腔边界处的基质重塑，分析认为原发性 CRC 管腔边缘的损伤可能有助于正炎症反馈回路，从而驱动富含髓细胞和中性粒细胞的环境在这些肿瘤中。

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A coordinated network of CXCL13+ T cells with myeloid and malignant cells（坐标网络）

Hub 6 由在髓细胞和恶性细胞中表达的 ISG/MHC II 类基因程序组成（可能由干扰素 g[IFNg] 诱导并由 IRF/STAT 转录因子驱动），其与 IFNG/MHC-II 和 CXCL13/ PDCD1 T 细胞程序。 这些 T 细胞程序包括激活和耗竭的标志物，已知这些标志物可以标记慢性刺激的肿瘤反应性 T 细胞。
重要的是，当将网络投影到 MMRp 特定分析中时，没有在特定于 MMRp 的分析中推导出这个hub，并观察到核心程序的活动较弱，并且网络的连接性降低（例如，恶性 pEpiTd19 和 T 细胞 pTNI18 程序之间的联系丢失） 数据集中的 MMRp 肿瘤和外部 scRNA-seq 数据集，与 MMRp 肿瘤较弱的免疫原性一致 。
为了验证 ISG/MHC-II 恶性和 CXCL13 T 细胞程序的协同活性，对来自 3 个肿瘤的组织切片进行了空间索引转录分析（GeoMx 数字空间分析，DSP），这些肿瘤在匹配 scRNA-seq 中显示出高 CXCL13 T 细胞程序活性。 我们分析了每个肿瘤切片的 45 个感兴趣区域 (ROI)，并进一步将每个区域划分为上皮和非上皮区域。 我们观察到每个肿瘤所有区域的恶性上皮区域的 ISG 表达与相邻非上皮区域的 CXCL13 表达之间呈正相关，进一步支持该hub恶性和 T 细胞之间的潜在相互作用。
除了由衰竭的 T 细胞表达的抑制性受体外，恶性 ISG/MHC-II 程序还具有抑制性分子，包括编码酶 IDO1 和 CD38 的转录物。 IDO1 和 CD38 在 4 个个体的恶性 ROI 中的表达与通过 scRNA-seq 测量的相同个体的表达相当。 此外，IDO1 或 CD38 表达与这两个基因的高 scRNA-seq 衍生表达和 CXCL13 T 细胞程序的个体的 ISG 评分在空间上相关。 这些结果表明，负反馈是中枢功能的一部分，并受每个肿瘤中患者特异性和区域特异性因素的调节。

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CXCL13+ T cells are localized within foci of CXCL10/CXCL11-expressing cells throughout the tumor

鉴于非恶性区域中具有 CXCL13 的恶性细胞中 ISG 的空间相关表达，我们假设 T 细胞将在空间上组织在表达 T 细胞吸引趋化因子的细胞周围。 我们检查了 hub 6 基因程序中的所有趋化因子，发现髓系、恶性和间质 ISG 程序包括趋化因子 CXCL9、CXCL10 和 CXCL11，并且它们的同源受体 CXCR3 在活化的 T 细胞和某些树突状细胞 (DC) 亚群中上调 .使用我们的三个高度 T 细胞浸润样本（个体 C107、C110 和 C132）的空间索引转录组学数据集，我们通过发现非上皮细胞中的 CXCL13 表达与相同 ROI 的恶性细胞中的 CXCR3 配体表达相关联来验证这一观察结果。
为了在单细胞分辨率下进一步验证这种空间关联，我们对来自 scRNA-seq 队列的 9 个 CRC 标本进行了全切片染色。 我们发现 CXCL10/CXCL11 阳性细胞聚集成大病灶，富含表达 CXCL13 和/或 IFNG 的细胞以及 CD3E+ T 细胞。 有趣的是，具有高（3 MMRd 和 1 MMRp）与低（2 MMRd 和 3 MMRp）CXCL13+ T 细胞程序活性的标本中的病灶倾向于分别在恶性细胞和非上皮细胞中显示 CXCL10/CXCL11 表达，但需要额外的研究确认这个观察 。
在所有样本中，与 CXCL10/CXCL11 阴性对应物相比，CXCL10/CXCL11+ 恶性细胞平均更接近 CD3E+、CXCL13+ 和 IFNG+ 细胞，并且这些距离在病灶内特别小。 最后，pTNI18（CXCL13 程序）和 pEpiTd19（ISG 程序）具有更高 scRNA-seq 活性的样本有更多细胞参与 CXCL10/CXCL11 病灶。 因此，我们的研究结果揭示了激活的 IFNG+ 和 CXCL13+ T 细胞以及 CXCL10/CXCL11+ 骨髓和恶性细胞的空间组织病灶，提供了一个正反馈回路的证据——T 细胞衍生的 IFNγ 诱导 CXCR3 配体的表达以吸引更多的 T 细胞——可能是对于在肿瘤内形成这些免疫细胞热点至关重要。

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DISCUSSION

肿瘤是异质的，但肿瘤内的免疫细胞可塑性较差，表现出的行为也更为有限。 在这里，我们确定了重复的、空间组织的细胞-细胞相互作用，这些相互作用有助于 MMRd 和 MMRp 肿瘤中协调的多细胞免疫反应。
这里的研究表明，T 细胞组织在人类肿瘤内的结构化细胞邻域中。 hubs的形成可能取决于正反馈回路，其中 T 细胞表达的 IFNG 驱动 CXCR3 趋化因子（作为 ISG 反应的一部分）的诱导，然后吸引更多的 T 细胞和其他细胞。 最近的研究表明，在小鼠检查点抑制剂治疗后，诱导抗肿瘤 T 细胞反应需要骨髓细胞中 CXCR3 趋化因子的表达来支持这一观点。 此外，几项研究已将 CXCR3 趋化因子系统与 T 细胞进入组织联系起来，包括黑色素瘤中的 CD8+ T 细胞募集、病毒感染和疫苗接种，其中局部 CXCL9 和 CXCL10 给药将活化的 T 细胞募集到上皮组织中，即使没有抗原。在human样本中，与我们在 hub 6 程序中观察到的基因重叠的 IFNγ 诱导特征与多种人类肿瘤类型中对 PD-1 阻断的有利反应相关。 此外，最近对 7 种肿瘤类型（包括 CRC）的meta-analysis发现，克隆性 TMB 和 CXCL9/CXCL13 表达是检查点抑制剂反应的最强预测因子。 与正反馈回路相反，肿瘤中持续的 ISG hub可能会驱动免疫抑制，因为负反馈会上调共抑制因子，如 PD1/PDL1、Lag3/MHC-II、Tim3/LGALS9 和 IDO1。 事实上，B16 黑色素瘤小鼠模型中的机械工作表明 IFNg 可以驱动多基因抗性程序。 正反馈还是负反馈在特定位置或时间占主导地位对于确定跨肿瘤和治疗很重要。
另一个重要问题是这些多细胞免疫形成是否与先前观察到的组织结构相似。 TLSs 通常位于肿瘤浸润边缘以下，含有hub B 细胞，并且与高 T 细胞活性、良好的预后和对免疫治疗的有效反应有关。相比之下，hub 6 被发现在肿瘤hub并且没有生发hub，并且相对于正常结肠，肿瘤耗尽了 B 细胞。一些研究观察到不太可能是 TLS 的聚合。在黑色素瘤免疫的早期研究中，IFNg、T 细胞和 PD-L1 的染色显示它们在肿瘤中的空间接近性。另一组观察到干细胞样 CD8+ T 细胞与 MHC II+ 类细胞的聚集，这与受影响个体中进展较慢的肾癌有关。第三项研究表明，小鼠接种疫苗诱导了表达 CXCL10 的 T 细胞和骨髓细胞的 IFNg/CXCR3 依赖性空间hub。这个hub在脉管系统周围形成，促进循环 T 细胞进入组织，为 T 细胞与其他细胞频繁接触以协调免疫反应提供平台。

另一个hub以炎症 CAF、单核细胞和中性粒细胞之间的炎症正反馈回路为hub，位于管腔表面。结肠肿瘤的管腔表面有异常的上皮衬里，肿瘤块突出到肠腔中，在那里它可以受到结肠内容物的磨蚀性损伤。组织损伤可能导致微生物配体进入或从死细胞中释放免疫刺激配体，从而导致炎症。炎症反应可能与可导致肉芽组织的伤口愈合反应交织在一起。有趣的是，最近对小鼠的一项研究表明，损伤诱导的白细胞介素-1 (IL-1) 可以触发 GREM1+ 间充质细胞中 RSPO3 的表达，这表明炎症中枢与基质细胞的转录和空间重塑之间可能存在联系我们在人类 CRC 中观察到的隔室。事实上，我们在管腔表面观察到扩张的血管，与先前在 CRC 中的研究一致，这些血管被表达基质金属蛋白酶 (MMP) 的高度炎症成纤维细胞包围，已知有助于肿瘤血管生成和组织重塑。炎症hub还具有 Treg 程序和包括 IL-17 在内的 T 细胞程序。 IL-17 已被证明可促进小鼠模型中的血管生成和肿瘤扩张，包括通过 CAF 激活和募集可支持肿瘤生长的粒细胞。因此，炎症hub的多个特征与抑制抗肿瘤反应和促进肿瘤生长有关。

本文的研究提供了丰富的细胞状态、基因程序及其在肿瘤中的转化（例如在基质细胞中观察到的深刻变化）的丰富数据集，涉及相对较大的 CRC 患者队列。 基于基因程序的共变和随后两个免疫恶性hub的空间定位对几个多细胞hub的预测将大量细胞状态和程序组织成较少数量的细胞和过程协调网络。 了解这些枢纽背后的分子机制并研究它们在治疗时的时间和空间调节对于推进癌症治疗至关重要。

Method（我们关注重点方法）

scRNA-seq pre-processing and quality control filtering（这个地方质控部分更加精细）。

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Selection of variable genes, dimensionality reduction and clustering（与我们常规做法也不太一样，尤其降维用到了NMF）

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Cluster assignment by gradient boosting and filtering of potential doublets

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Classifying malignant cells by gradient boosting（肿瘤等级与层次，肿瘤研究中非常重要）。

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Identification of gene expression programs by NMF（识别基因程序，这个之前分享过）

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Identification of shared gene programs in malignant epithelial cells（识别共享的基因程序）

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Calculating NMF transcriptional program activity（原理就是基因集打分）

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Testing for covarying NMF expression programs（共表达程序）

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Constructing a network of expression program similarity（构建表达程序相似性网络）

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Image analysis, neighborhood definition, and clustering（图像方面的处理）

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生活很好，有你更好