• 原文： The pros, cons, and many unknowns of probiotics

• 杂志： Nature Medicine volume 25, pages716–729(2019)

• 10.1038/s41591-019-0439-x
• 作者：Eran Elinav
• 单位： Immunology Department, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel Cancer-Microbiome Research Division, DKFZ, Heidelberg, Germany

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摘要：

*近年来，在全球范围内，用于促进健康和福祉的非处方益生菌的消费量有所增加。 然而，尽管益生菌的使用已在公众中大为普及，但是许多益生菌菌株和制剂的临床结果却存在矛盾。 ·微生物组研究的新见识可以评估益生菌对肠道定植的影响，菌株水平的活性，与本地微生物组的相互作用，对宿主的安全性和影响，并使益生菌与生理效应和潜在的有用医学适应症相关联。 ·在此观点中，我们重点介绍了在努力对非处方益生菌的大量数据进行无偏见的解释方面的主要进展，挑战和局限性，并提出了改善证据质量，透明度，公众意识及其监管的途径 ·采用。 ·

主要内容：

• 数百年来，人们一直以口服食用微生物作为诱导健康益处的概念。 ·“益生菌”一词在1974年首次出现在这种情况下，并在概念上发展到目前的通用定义，即活的微生物，当食用足够量的健康微生物时，就会产生健康益处，这是由美国粮食及农业组织/世界卫生组织于2002年提出的。 如今，益生菌构成了一个不断增长的数十亿美元的产业 ，并且是全世界最常用的食品补充剂 。 酸奶，奶酪，冰淇淋，零食和营养棒，早餐谷物和婴儿配方食品等食品都添加了益生菌 。 ·益生菌也可以冻干药的形式商业化 。 ·益生菌的消费得到医生 ，特别是肠胃病医生 的广泛支持。

• 尽管益生菌很受欢迎，但是数十年来关于益生菌在疾病治疗和预防中功效的研究数据常常指向相反的结论，并且在许多情况下仍然存在冲突，争论和混乱。

• 此外，主要的医学监管机构，例如欧洲食品安全局 和美国食品和药物管理局 ，尚未批准任何益生菌制剂作为治疗手段。 因此，益生菌作为膳食补充剂的市场营销通常是由诸如安全性，胃肠道（GI）的生存力以及对食物味道的影响等特性所驱动，而不是由明确的健康促进作用所驱动。

• 这种令人困惑的状态值得更好地以证据为依据，证明益生菌对人类的影响及其不利影响 。

• 在此《观点》文中，我们将重点介绍和讨论当前益生菌研究方法的一些主要前景和局限性，在解释现有数据方面提出挑战，并提出可能的策略来阐明这些问题，并将对益生菌的研究转化为更具可重复性和有效性的研究。 ·普遍接受的基于度量的方法。 在我们的工作中，经过审查的非处方微生物干预措施将被称为益生菌，无论其益处和功效或缺乏益生菌。

• 值得一提的是，本《观点》的目的并非要审查正在提议作为各种医学适应症干预措施的，非商业用途的“下一代”微生物治疗方法。 ·这些将在其他地方讨论。
  我们将重点介绍一些值得注意的例子，讨论以下内容：**评估益生菌对健康的益处的证据和临床解释方面的“已知”和挑战； 建议的益生菌作用机制，与是否需要肠道定植有关的辩论； 益生菌菌株与肠道微生物组的相互作用； 安全性; 和未来的方向。

临床疗效

• 益生菌对人类的影响已被科学家以及食品和药品行业广泛研究了数十年。 这导致了多种建议的预防和治疗健康适应症和主张，例如预防或治疗急性，抗生素相关性和艰难梭菌相关性腹泻。 改善炎症性肠病和肠易激综合症（IBS）； 降低新生儿迟发性败血症和坏死性小肠结肠炎的风险。 其他要求包括消除幽门螺杆菌，减少呼吸道感染的发生率和严重性，减轻抑郁症，预防或治疗特应性皮炎以及减少与心血管代谢综合征相关的心血管危险因素 。**遗憾的是，尽管与上述健康声明相关的某些临床试验具有很高的方法学质量和有效性 ，但对于大多数上述适应症，也有类似方法的研究，其特征为阴性或阴性或相反的结果，共同导致矛盾，模棱两可和值得商总的结论。

• 当前令人困惑的情况可能源于许多问题，包括以下事实：益生菌试验的许多读数均基于经验性临床数据，这些数据在收集方法，临床终点和分析严谨性方面有所不同。 **许多报告使用定性的，自我报告的“幸福感”参数，例如情绪或社交功能 **。 其他人提供了不一定具有临床意义的标记物的量化，例如健康个体中炎症标记物C反应蛋白（CRP）在临床上的减少或葡萄糖刺激的胰高血糖素样肽1（GLP-1）升高不明显。

• 同样，这些试验中分析的系统也存在很大差异，包括细胞培养，体外研究，动物模型和人体研究（可能是观察性或随机，安慰剂对照试验）的推断。
  有时，即使在高质量，安慰剂对照的研究中，不同的试验也发现了益生菌相互矛盾的推定益处 。 益生菌研究变异性的另一个原因是所研究菌株的差异。 如今，益生菌行业中使用的优势微生物还属于乳杆菌属和双歧杆菌属，以及乳球菌属，嗜热链球菌属，大肠杆菌Nissle 1917年和酵母菌boulardii 。

• 虽然某些健康相关的作用机制在多个益生菌属和物种中很常见（例如，胆汁盐水解酶的产生） ，但其他性状可能是物种特异的，甚至是菌株特异的，或者可能需要不同菌株之间的相互作用才能产生效果。 为了抵消上述方法和分析的局限性并克服不足的发现，研究人员和临床医生经常以系统评价和荟萃分析的形式整合多项研究的结果。 使用此类工具在揭示总体趋势方面可能非常有用； 但是，它也可能会受到每个分析步骤 中可能引入的误差的影响，例如纳入支配总体结果并掩盖实际效果的异常研究，或者缺乏这些误差。

• 特别是，有关益生菌的荟萃分析有时会倾向于在同一保护伞下对测试各种无关的补充微生物进行分组研究，从而有可能对结果进行过度或错误的解释 。 因此，即使是针对相似主题的荟萃分析也可能彼此冲突28,29。 ·因此，我们认为，荟萃分析可以补充但不能替代高质量，大规模，多中心，随机对照的临床试验。

• 此外，与动物模型不同，人类在饮食，年龄范围，遗传背景和肠道微生物组构型方面高度异质，因此对同一干预措施的反应可能不同。

• 确实，一些益生菌研究已表明精确度的重要性，因为不同结果取决于与宿主及其微生物组或饮食有关的因素（图1）。 具体而言，如以下各节中进一步讨论的，益生菌在肠道中的定殖程度在个体之间存在很大差异，这可能会导致益生菌对其宿主和/或肠道微生物群产生不同的影响。

图1：益生菌的作用蓝图

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• 宿主及其微生物组的不同初始条件以及变化的环境暴露可能会在补充了相同益生菌制剂的不同个体中导致不同的结果。 益生菌的体外特性，如附着力，疏水性和自动聚集，可能会有所不同，具体取决于它们被分离出来的宿主。 已知潜在的医学状况，如特应性皮炎 或牛奶超敏性 ，会改变益生菌对宿主免疫细胞的作用。 土著微生物组的特征也可以解释益生菌对宿主的不同影响，因为允许益生菌定植的微生物群与IBS202和结肠炎 和抑郁症 的鼠模型的女性临床症状改善有关。 这些允许的微生物群也更容易响应益生菌而发生组成和功能改变，与具有抗性微生物群的宿主相比，其宿主的肠上皮在不同的途径中富集 。·补充前的丁酸盐水平还与益生菌对微生物组和丁酸盐产生或代谢的不同作用相关 。·饮食还可能影响益生菌的性质，因为膳食多不饱和脂肪酸（PUFA）会在体外调节益生菌的粘附力。 同样，饮食也可能影响临床结局，因为用母乳喂养的早产儿表现出降低的迟发性败血症风险和更短的时间实现全肠道喂养，而配方奶喂养的婴儿则并非如此。

最后，许多益生菌研究是由益生菌行业的商业实体或与同一行业紧密相关并由其资助的专业游说团体联系，资助，发起和认可的。 ·尽管这种现实本身并不一定会损害此类研究的有效性，但对通过科学和医学实体的非附属研究来独立确证功效声明存在需求和兴趣。 ·益生菌最常与有益结果相关的某些适应症的例子如下所述。

急性肠胃炎

• 已建议益生菌可有效预防或治疗表现为急性腹泻的各种儿科和成人病因。 多项荟萃分析和系统评价表明，某些制剂 ，特别是包含布拉氏链球菌 ，鼠李糖乳杆菌GG（LGG） 和乳杆菌属 内其他菌株的制剂，可能会减轻儿童的急性腹泻并将其持续时间缩短约1天。同样，已证明益生菌可有效预防和治疗成人急性腹泻，并且已提出各种制剂，特别是涉及布拉氏链球菌和鼠李糖乳杆菌的制剂，均可改善健康儿童，成年人和住院患者的抗生素相关性腹泻 。
• 相反，其他研究和荟萃分析显示，益生菌在预防儿童 ，成人 和老年人 的腹泻功效方面存在矛盾的结果。 值得注意的是，最近进行的两项高质量，大型，多中心，随机安慰剂对照试验的结果评估了鼠李糖乳杆菌（LGG或R0011）与瑞士乳杆菌R0052或不包括瑞士乳杆菌的治疗，对1800例急性肠胃炎儿童进行了评估。 ·向急诊科证明没有临床益处 。 ·较早的一项对4,000多名儿童的荟萃分析表明，该指征的证据质量从低到非常低 ，这导致了一套临床管理指南中遗漏了益生菌 ，而另一项研究仍主张使用LGG ·S. boulardii和S. boulardii，同时指出这些建议所依据的证据质量低下 。 尽管存在争议，但许多父母在患肠胃炎并服用含有益生菌的“功能性食品”时会对其进行“自我治疗” 。

艰难梭菌相关性腹泻

• 当微生物组赋予的定殖抗性受到损害时，例如在住院患者进行抗生素治疗后，艰难梭状芽孢杆菌会在肠道中生长。 结果是该疾病的严重程度可能从轻度腹泻到威胁生命的疾病（称为假膜性结肠炎）不等。 ·几项荟萃分析显示，口服益生菌具有累积的有益效果：预防艰难梭菌感染或与其相关的发病率47，尤其是在接近抗生素暴露 的情况下。 2017年对8,672例病例（包括不同的益生菌菌株，年龄，剂量和给药时间）进行了荟萃分析，进一步发现了预防用抗生素治疗的艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）的中度有益证据，但指出 ·在试验之间存在相当大的异质性，并且使用事后分析表明，在基线和中等基线CDAD风险较低的人类受试者的试验中，益生菌对CDAD的预防没有显着影响 。 ·另一项荟萃分析得出结论，在各种益生菌菌株中，只有博拉氏链球菌对艰难梭菌有效，尽管专门针对博拉氏链球菌的另一项荟萃分析发现，它降低了儿童而非成年人的CDAD风险 。
• 进一步检查构成这些荟萃分析基础的各项研究后，我们发现在安慰剂和安慰剂治疗的大多数试验中，试验期间艰难梭菌的发病率不存在（8个试验，补充表1）或较低。 ·治疗组和荟萃分析中包括的绝大多数试验（34个试验，补充表1）均未证明不同菌株的益生菌对CDAD或艰难梭菌感染具有显著作用。 尽管这可能与这些研究的能力不足以证明在艰难梭菌发病率低的情况下产生效果有关，但两项以难辨梭状芽孢杆菌发生率高的人群为特征的随机对照试验（RCT），包括最大的试验 ·迄今为止，对于这种适应症的益生菌的使用，在治疗组和安慰剂组之间没有发现差异。因此，益生菌对CDAD的预防作用主要得到少数研究的支持，这些研究显示出显着的作用 ，其中两项是未经同行评审的会议摘要 。 尽管在大多数研究中发现安慰剂组的艰难梭菌发病率很高， 但CDAD不常见的其他研究，益生菌预防在安慰剂组中的疗效较低。总之，队列中CDAD基线风险的可变性以及大多数荟萃分析汇总了测试各种益生菌菌株（真菌和细菌）的研究的事实 ，可能解释了研究之间结果的差异。

肠易激综合症和消化系统不适

• IBS是一种病因不明的常见且临床可变的疾病。 评估干预措施以减轻IBS的试验通常受到以下事实的限制：该疾病是由主观标准定义的。 因此，至关重要的是要确保益生菌缓解IBS症状不等于或逊于安慰剂作用 。 最近的一项荟萃​​分析表明，益生菌可能有效治疗IBS63症状，尽管应注意的是，没有一种单菌株制剂被证明可有效缓解腹痛或治疗腹胀，肠胃气胀和肠急。 即使在益生菌组合中，也发现某些药物可有效减少症状持续性和腹痛评分，而另一些则无效，这强调了知情选择菌株对疾病结果的重要性。 相应地，对篇系统综述和35篇RCT进行的系统综述未发现各种益生菌菌株治疗IBS症状的功效的证据64。

新生儿败血症

• 益生菌功效的一个有前途的迹象是预防新生儿迟发性败血症和/或坏死性小肠结肠炎（NEC），肠胃炎通常会影响早产儿 。 动物模型和人类细胞培养物中的研究表明，针对NEC的保护机制可能涉及抗病原体的粘膜保护，以及某些益生菌菌株（例如LGG）诱导的先天免疫和肠道上皮细胞成熟，从而促使炎症反应减弱。 此外，最近的一项大型RCT证实了印度农村的母乳喂养婴儿（n = 4,556婴儿），他们接受了口服植物乳杆菌PP 11-217和益生元低聚果糖的组合，从而加强了上述研究的结果。 ·来自新生儿败血症和死亡12。 ·但是，在一项对1,310名非常早产的英国婴儿进行的试验中，向婴儿肠内喂养配方食品的短双歧杆菌BBG-001对预防NEC或败血症没有显著作用。 2014年的Cochrane评估（包括5,000多名婴儿）不包括这两项研究，得出的结论是，单独含有乳杆菌或与双歧杆菌结合的肠内益生菌可降低早产儿NEC的发生率和死亡率，但不降低医院败血症的发生 。 另一项系统评价和荟萃分析得出的结论是，益生菌只有在混合使用时才有效预防早产儿败血症（与单一菌株相比），并且仅在婴儿由人乳喂养时才有效（相比 ·独家配方或混合喂养）71。 ·两项荟萃分析报告说，益生菌对极低出生体重婴儿预防NEC72或败血症无统计学意义。 因此，即使在这种有前途的适应症中，在治疗（例如，菌株组成，剂量，给药方式和益生元的掺入方式）和患者（例如，与出生体重和环境有关的基线风险）方面也都需要保证精确度 ·接触微生物和饮食）。 重要的是，益生菌对本地肠道微生物组发展的长期影响及其对肠道免疫，代谢和解剖学发展的影响值得进一步研究。

急性呼吸道感染

• 几项系统评价和荟萃分析表明，益生菌可以有效降低儿童，成人，老年人甚至运动员的感冒，呼吸道感染和流感样症状的严重程度，持续时间和发病率。 然而，在这些荟萃分析中，证据质量被认为是低到非常低，并且关于治疗效果的研究之间的异质性被认为是重要的。 ·一项涉及儿童和成人研究的荟萃分析表明，益生菌可以降低呼吸道感染的严重程度和持续时间，但不能降低其发生率 。 ·这些差异有时可能源于对主观或间接评估感染的依赖，例如自我报告 或者是根据抗生素治疗持续时间或缺勤天数推断出疾病持续时间。
• 当治疗组在基线时不同时（例如年龄和先前感染的数量82），没有明确临床或生物学依据的二次抽样83,84，无法解释的从荟萃分析中排除试验75和归因于临床的原因，也可能是由于未经调整的结果导致差异。 ·尽管剂量-反应关系不符合直觉，但对治疗的影响84。 在因果关系上，非常需要以数据为依据的解释，说明胃肠道定位的益生菌影响远端器官疾病的机理。

肠道定植

• 与益生菌的作用机理有关的未解决的问题涉及所施用的微生物稳定地或什至瞬时地定殖在宿主胃肠道粘膜表面的能力，以及它们的定殖是否对对宿主产生有益影响是必需的。 益生菌菌株与肠上皮层的接近可能对实现宿主-微生物相互作用具有重要的机械作用，例如接触依赖性免疫调节 ，有效浓度的代谢产物分泌 和粘液层修饰 。 这场长达数十年的辩论包括两个固有的与殖民有关的独特问题，下面将进行讨论。

补充期间肠道粘膜定植

• 食用期间益生菌会在肠道粘膜上定居吗？ ·令人惊讶的是，直到最近，人类仍未以全面的方式直接探索这个至关重要的主题。大多数关于益生菌定殖的说法都是从对粪便中的益生菌种类的评估中推断出来的，而没有直接检查这是否真的反映了它们的定殖能力，微生物在胃肠道中的通过以及它们排泄到粪便中 。 像粪便评估一样，由于体外存在的大量宿主和微生物组因子，益生菌在体外对人GI细胞的粘附可能是体内定植的不良指标。 ·
• 通过内窥镜检查在一些试验中确定了对粘膜益生菌定植的直接定量，并且在人类 和猪 中进行了一些研究。 这些研究中的一些表明，益生菌可以在补充期间或什至补充后从各种胃肠器官中分离出来，而另一些则显示出高度有限的和可变的定殖模式，仅在少数被测个体中观察到 。 值得注意的是，在这些研究中，通过培养或16S rDNA技术对益生菌的存在进行评估，大大限制了所施用的益生菌菌株和与益生菌密切相关且属于相同物种和/或属的内源性共性（ ·见专栏1）。 在食用11种属于4种最广泛使用的益生菌属（或安慰剂）的益生菌菌株之前和之后，通过结肠镜检查和胃镜检查对人类参与者进行了对物种和菌株敏感的宏基因组学评估，结果发现 例与粘膜相关的益生菌在扩展 ·％的补充个体，即使在通过超灵敏qPCR进行测量时，其他40％的集落抵抗力也几乎相同。 ·粘膜结合程度与粪便中益生菌菌株的繁殖无关，可以通过基线宿主和微生物组因素的组合来预测，这凸显了为个体量身定制益生菌的潜在未来前景。 ·有趣的是，将粪便微生物组从“抗药性”或“允许性”人群移植到无菌（GF）小鼠中，概括了供体对益生菌定植的敏感性，表明存在主要的微生物组介导的定植抗药性机制。
• 假定的非菌落依赖性益生菌对宿主的影响，例如对食物消化的影响，是基于证据的实验证据。 ·鉴于此，在上述研究中，即使在主动食用期间甚至在肠腔中也未检测到“抗性”个体中的89种益生菌菌株102，这表明暂时和/或持续定居的与黏膜相关的益生菌可能是腔内细菌的重要贮藏库。

Box1: 益生菌研究中的微生物组分析策略

• 现在，在研究益生菌与居民微生物群落之间的相互作用时，微生物组研究领域的进展可以提供更精细的分辨率，同时解决了以前的方法学局限性和可能解决对比报告的偏见。 造成这种混淆的主要原因是“微生物组改变”的宽泛定义。评估益生菌诱导的微生物群调节的大多数报告都利用粪便样品中的16S rDNA相对丰度（RA）。随着补充的益生菌在粪便中排泄，其RA的增加随之导致其他社区成员的相对数量（而非绝对数量）的虚假降低 ，有时被误解为微生物群修饰 。 同样，热灭活细菌的引入将其遗传物质添加到样品中，因此影响相对丰度 。 因此，所施用的益生菌菌株的RA升高不应被解释为对微生物组的真正作用。 ·
• 另一个重要的局限性是基于16S rDNA的分析无法区分补充的益生菌菌株和同一物种的密切相关的内源成员，导致补充菌株的丰度增加，这被解释为内源性恢复。 **利用基于培养物的方法或物种特异性探针可以通过描述益生菌相关的绝对丰度变化来克服这一问题，同时考虑到补充菌株的生存能力，但与描述前的补充结构相比，无法描述微生物组构型的整体变化或 用安慰剂治疗后（β多样性）或物种丰富度发生变化（α多样性）。 然鸟枪宏基因组测序也可能导致报告冲突 ，但它具有菌株级分辨率和鉴定益生菌对微生物组功能的潜在作用的优势。 有趣的是，尽管对整体组成没有明显影响，但已有几项研究报告了从基因，途径或微生物代谢产物方面来看，益生菌对微生物组功能的影响，尽管这些功能性微生物组的改变可能是补充益生菌菌株产生的基因的产物， ·而不是调节微生物群落 。 另一个局限性是益生菌可能对寻求的“健康微生物组”的定义。 即使在评估确实提示益生菌相关的微生物组调节的研究时，也无法达成此类影响的共识，而且在许多情况下，益生菌引起的微生物组变化的报道也存在冲突。 例如，产气荚膜梭菌或大肠埃希氏菌 就是这种情况，并且在各种临床环境中都是这种情况174。 例如，在IBS（n = 28）213的个体中发现了与产生益生菌有关的产生丁酸盐的细菌（主要属于梭菌）的粪便大量繁殖，以及Bilophila wadsworthia和disparasonoides distasonis的减少，并且 （针对B. wadsworthia） 在一组响应者的单独人群中（n = 107），他们在干预后症状有所缓解202； ·但是，第三个RCT（n = 55）219没有重现此内容。 ·重要的是，即使在施用益生菌与微生物组变化有关的情况下，这些变化也可能源于疾病的调节，而不是直接来自暴露于益生菌。 ·据我们所知，迄今为止，尚无研究证明益生菌相关微生物组调节在改善疾病表型方面具有直接因果作用。

补充后肠粘膜的持久性

• 益生菌是否即使在停止食用后仍会在肠道粘膜上持续定植？ ·即使在允许的个体中，仍不清楚补充剂停止后是否维持益生菌定植。 ·在饲喂含有五种益生菌菌株的发酵乳产品（FMP）的大鼠中，所有菌株在饲喂期间都在粪便中脱落，但是只有一部分大鼠继续脱落了五种益生菌菌株之一（乳酸乳球菌CNCM I-1631 ·）在补充后的2天。 ·将宽容或抗性大鼠的独特微生物群落转移到无菌大鼠中，可以复制供体的定植性103。
• 在接受益生菌补充剂的人类中，已经描述了婴儿双歧杆菌 （参考文献104），动物双歧杆菌乳酸菌Bb-12（参考文献105），嗜酸乳杆菌R52（参考文献106）在粪便中检测到的减少的益生菌：干酪乳杆菌DN-114 ，约翰逊乳杆菌 ，植物乳杆菌 ，罗伊氏乳杆菌DSM17938 ，鼠李糖乳杆菌 ， 唾液CECT5713 等。 ·但是，在大多数研究中，随访时间仅限于停止消费后的1-2周。 ·长期随访发现的模式表明，应变和特定于人的持续性变异性。 ·补充停止后两个月，只有十个人之一检测到鼠李糖乳杆菌 ，而三分之一的长双歧杆菌AH1206消费者在停药后的六个月内仍在粪便中排出益生菌 。 ·在补充了上述五株FMP的人类中，也注意到了受试者和菌株特定的后裔脱落现象，其中在停止后5周，粪便样品中仅脱落了乳酸乳球菌CNCM I-1631，并且只有一部分个体有所不同。 ·来自非携带者的预补充微生物组组成 。

作用机制

• 研究人员推测，益生菌的有益作用是通过多种机制发生的，包括诱导免疫调节，抵抗生理压力，抑制病原体，调节微生物组以及改善肠上皮的屏障功能（图2）。 ·这些机制性的益生菌研究通常受到几个主要限制，包括严重依赖于细胞培养系统的利用，而这些系统并不能说明决定复杂胃肠道粘膜微环境中微生物与微生物以及微生物与宿主之间相互作用的生理线索。 ·复制体内试验。 这些研究的其他局限性在于，与人类相比，鼠胃肠道粘膜中外源“与人类相容”的益生菌的定植能力差 。 ·宿主之间的不一致可能在功能上很重要，因为与携带鼠类微生物组的小鼠相比，对小鼠进行人类奖赏可以对免疫系统 或宿主代谢组 产生明显不同的影响。 ·重要的是，某些益生菌性状可能统一存在于该物种的不同成员之间，甚至在该属之间，例如双歧杆菌属。 ·和乳杆菌属。 ·产生β-半乳糖苷酶，可以弥补乳糖酶不足 ，而其他性状可能是物种-122甚至菌株特异性123，或者需要益生菌菌株124之间的相互作用，这将在下面进一步讨论。 ·已经提出了几种主要机制参与益生菌的效应子功能，如下所述。

图2：益生菌与宿主及其微生物组之间的机制相互作用

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益生菌可能对宿主产生多种影响，包括营养物质的代谢以改善消化（例如乳糖）或产生全身性作用（例如胆汁盐）；·直接和间接的病原体拮抗作用（但也可能促进毒力）；·改善屏障功能，改变微生物组；·改变神经系统的信号；·和免疫调节。·这些可能是接触依赖性和/或由表面分子（例如脂蛋白酸（LTA），sEPS，SpaCBA和分选酶依赖性菌毛）介导的，或由分泌分子（例如短链脂肪酸，细菌素，p40和p75）介导的。·）。·虚线表示推定的机制。·BSH，胆盐水解酶；·β-gal，β-半乳糖苷酶；·SlpA，S层蛋白A；·sIgA，分泌的免疫球蛋白A；·DC，树突状细胞；·MOR，阿片受体；·PVN，下丘脑室旁核；·TGF-β，转化生长因子β；·TLR，收费型受体；·LPS，脂多糖；·ROS，活性氧；·TH，T辅助细胞；·Treg，调节性T细胞。

免疫调节

• 许多研究表明，益生菌会对免疫相关基因的表达，炎症途径活性和免疫标记物水平产生影响，包括调节肠上皮细胞NF-κB，促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），Akt（也称为 ·磷酸肌醇3激酶（PI3K）），过氧化物酶体增殖物激活受体-γ，CRP，白介素（IL）-6，IL-8，肿瘤坏死因子（TNF）-α，IL-1β和干扰素γ（IFN-γ） ·，通过多种主要依赖于接触的机制（参见参考文献125）。 **有趣的是，在一些研究中，活细菌和死细菌对基因表达有不同的影响，这表明细胞表面和主动分泌的分子都可能影响肠道转录组 。 益生菌对宿主的免疫影响的其他示例包括通过脂磷壁酸（LTA） ，乳酸杆菌介导的toll样受体2（TLR2）依赖性刺激TNF-α分泌，长双歧杆菌介导的接触依赖性IL-10 ·双歧杆菌分泌 ，分选酶依赖性菌毛引起TNF-α反应90，长双歧杆菌中细胞表面胞外多糖（sEPS）36524调节肠道和肺中的促炎细胞因子和T辅助细胞17（TH17）反应以及免疫刺激性细胞表面附件 ·LGG中称为SpaCBA的化合物，介导（体外）与人肠粘液的结合以及TNF-α，IL-6，IL-10和IL-12的TLR2依赖性调节（参考资料 ）。

• 体内机制的其他例子包括LGG诱导活性氧的产生，以及随后通过SpaC介导的对肠上皮的粘附来抑制TNF-α诱导的肠NF-κB活化； ·唾液乳杆菌Ls33的肽聚糖，而不是嗜酸乳杆菌NCFM的肽聚糖，以含核苷酸结合的低聚域蛋白2（NOD2）–IL-10-依赖性的方式保护小鼠免受化学性结肠炎的侵害 ； ·嗜酸乳杆菌L-92与微折叠细胞（M细胞）结合，通过其表面层蛋白A（SlpA）132进行免疫调节； ·婴儿芽孢杆菌35624诱导人中依赖TLR2的T调节细胞 ； ·动物乳杆菌Bb-12诱导IgA分泌 。 ·总的来说，以上大多数例子都指出，宿主细胞和益生菌之间需要物理接触或接近，以潜在地诱导促炎和抗炎反应，这突出了施用益生菌的重要性。 ·在定殖的个体中观察到的这种变化的临床结果，无论是否有益，都值得进一步的人类研究。

预防病原体

• 有人建议益生菌通过附着在上皮细胞上并物理阻断病原体的粘附能力来抑制病原体的定殖。 这已在培养物中显示136，并间接在小鼠中显示沙门氏菌和嗜酸乳杆菌LAP5或发酵乳杆菌LF33（参考文献137）。 ·嗜酸乳杆菌A4还可以通过粘蛋白2（MUC2），IL-8，IL-1β和TNF-α的上调来拮抗大肠杆菌O157：H7对肠上皮细胞的粘附（参考文献138）。 ·几种双歧杆菌属。 已显示在体​​内产生乙酸盐，从而通过酸度相关的机制抑制产生志贺毒素的大肠杆菌O157：H7 。 ·几种乳酸菌可以产生细菌素，它们是具有抗菌活性的化合物 。 ·例如，唾液乳杆菌UCC118产生Abp118细菌素可保护小鼠免受单核细胞增生李斯特菌感染。 ·其他机制可能涉及仲裁感应（QS）的中断。 ·例如，嗜酸乳杆菌La-5抑制了autoinducer-2（AI-2），并降低了大肠杆菌O157：H7的某些毒力因子的表达 ； ·嗜酸乳杆菌GP1B在体外抑制艰难梭菌的AI-2活性，将其施用于艰难梭菌感染的小鼠可提高其存活率 。 ·罗伊氏乳杆菌RC-14和罗伊氏乳杆菌RC-14产生介体，以干扰金黄色葡萄球菌QS，从而抑制其毒力，包括中毒性休克综合征毒素-1的表达（参考文献144）。 ·重要的是，QS分子的产生和对QS信号的响应是病原体和亲属之间共有的性状 。 ·因此，体内QS信号的复杂性和响应者的数量可能不同于体外实验 ，而且体内QS的操作甚至可能导致共生细菌的抑制 。

改善屏障功能

• 益生菌已提出了几种稳定肠屏障功能的潜在机制，其他地方对此进行了综述 。 它们包括紧密连接（TJ）蛋白（claudin-1，occludin和ZO-1）的上调和跨上皮电阻的改善，粘液分泌的促进（通过结肠上皮细胞中MUC2，MUC3和MUC1的上调）和丁酸盐的升高 ·水平，以及微生物组调节。 ·这些作用可能是由局部分泌的代谢产物介导的。 ·例如，植物乳杆菌产生羟基-顺式-12-十八碳烯酸（HYA），已被证明可抑制TJ通透性以及IFN-γ和TNF-α诱导的occludin，ZO-1和claudin-1的下调。 ·通过G蛋白偶联受体（GPR）-40–丝裂原激活的蛋白激酶（MEK）–细胞外信号调节激酶（ERK）途径调节TNF受体2的表达来培养 。 ·在小鼠中，HYA在特应性皮炎模型150中减少皮肤TNF-α并增加claudin-1 150，并以GPR40依赖的方式改善病原体诱导的牙龈上皮屏障破坏 。 ·已建议从LGG纯化的两种分泌蛋白（称为p40和p75）通过抑制细胞因子诱导的上皮细胞凋亡来促进肠上皮稳态。 ·其他作用可能需要直接粘膜黏附，如由乳杆菌菌株在HT29细胞 中诱导的MUC3表达以及在Caco-2细胞中的MUC2和干酪乳杆菌GG所证明的 。 ·粘附的要求可以解释为什么在体内补充普通的商业VSL 3益生菌混合物会导致关于增加粘蛋白分泌能力的发现相互矛盾 。 ·重要的是，当试图在临床试验中验证这些发现时，研究人员发现了没有定论的结果，在某些试验中，针对多种潜在疾病，观察到了与益生菌相关的改善 ，而在其他试验中未观察到益智菌相关的改善。 ·这些差异是否代表了益生菌定殖的结果，早期的研究没有发现这一点尚待确定。

益生菌作用的其他建议机制

• 商业益生菌的先决条件之一包括对胆盐介导的生长抑制的抵抗力。 ·例如，乳杆菌和双歧杆菌属。 ·通过产生胆汁盐水解酶（BSH）来抵抗胆汁，胆汁盐水解酶可从类固醇核心上使甘氨酸或牛磺酸解离24。 ·BSH活性与全身有益的代谢作用有关，包括减少小鼠体重增加和血浆胆固醇和肝甘油三酸酯水平 ，以及降低人体胆固醇 。 但是，胆汁酸的去结合可能会导致膳食脂质的消化不良和胆结石的形成 ，以及葡萄糖耐量降低 。
• 也有人提出益生菌会影响肠道和中枢神经系统的信号传导，并赋予宿主抗焦虑，抗抑郁和伤害性的作用 。 ·饲喂鼠李糖乳杆菌JB-1的小鼠大脑中γ-氨基丁酸（GABA）-A和GABA-B受体的mRNA表达会发生特定的区域变化，这与皮质酮对压力和焦虑相关行为的反应减弱有关 ·，在经迷走角切除的动物中未观察到 。 ·然而，同一菌株未能调节人类的压力和认知能力 。 在小鼠中，母亲的高脂饮食会导致大坝和后代的肠道营养不良，这在后代的社交行为受损中起着因果作用（如将不良生物细菌谱移植到无菌小鼠中）。 用罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475而非约翰逊氏乳杆菌ATCC 33200进行治疗，可恢复母体HFD降低的室旁核催产素水平，并改善社交行为 。 ·罗伊氏乳杆菌DSM 17938还可能以瞬时受体电位类香草素1（TRPV1）依赖性的方式在大鼠中表现出抗伤害感受的作用 。 ·嗜酸乳杆菌NCFM诱导肠道上皮细胞中μ阿片和大麻素受体的表达，并在大鼠中具有镇痛作用 。
• 重要的是，益生菌在动物模型中产生的明显作用并不一定会转化为对人类的作用，正如最近有关益生菌对焦虑的影响的荟萃分析所证明的 。 因此，尽管益生菌具有有益地影响肠脑轴的潜力，但关键分子的作用仍然未知，对于将动物模型中的发现正确转化为与人类有关的疗法至关重要。

与宿主土著微生物组的相互作用

• 虽然益生菌对宿主的影响不一定与它们与本地微生物组的相互作用有关，但它们的使用通常与关于有益调节微生物群和干扰微生物群正常化的主张相关联，既可以作为自身的有利结果，也可以作为 益生菌保护宿主免受疾病侵害的机制 。 尽管如此，在健康个体中，益生菌调节宿主肠道菌群的程度（如果有的话）仍然存在争议。 ·一项2015年的系统综述报告了这一点，这一点在所分析的七项研究中有六项缺乏益生菌对微生物群的影响的证据 上，以及一项较早的系统综述分析了使用益生菌的不同试验的结果中，只有21％的结果 ·在微生物组改变中 。 重要的是，对宿主微生物组的推测影响可能源于分析偏见（Box1），并且缺乏表征益生菌对原位胃肠道微生物组影响的试验（Box2）。
• 可能影响益生菌调节微生物组能力的一个重要决定因素是暴露于益生菌之前肠道中的内源性微生物环境，这可能因个体而异。 ·抗生素会显着干扰微生物组 ，从而减轻对益生菌116以及病原体 的定植抗性。 ·在这种情况下，假定益生菌可在已清除的生态位中充当占位符，防止病原体定植和与抗生素相关的腹泻 ，或作为纠正与抗生素相关的营养不良的方法 ，但有证据支持益生菌具有促进肠道重构的能力。 ·受抗生素干扰后的微生物组通常基于细菌培养物或特定的荧光原位杂交或qPCR探针，这些探针仅占受干扰微生物组的一小部分，即使使用这种方法，报告的恢复也可能是部分 或最小，并备受争议 。
  总体而言，除了补充菌株，剂量和持续时间或微生物组分析所使用的方法 之外，大多数研究均不支持益生菌在食用期内益生菌菌株本身的短暂存在，而不在组成或功能微生物组调控中发挥作用。 在报告益生菌相关的微生物组变化的研究中，很难指出通常变化的微生物的变化模式。 尽管有些著作报道了微生物组的改变与健康促进作用同时发生，但没有一个因果关系，因此，迄今为止不可能事先声称这种微生物组的改变是有益的。

Box 2 量化益生菌对原位胃肠道微生物组的影响

*虽然粪便样本可能无法准确代表胃肠粘膜粘附的微生物组 ，但只有少数研究表明了益生菌对肠道微生物组的原位作用。 对植物乳杆菌299v补充的个体（n = 29）进行的基于文化的研究表明，粪便样品中梭状芽胞杆菌的富集，但直肠或升结肠结肠粘膜中富集。 同样，在补充了益生菌的人中，与他们自己的基线或安慰剂给予的人相比，在较低的胃肠道腔或粘膜微生物组上也没有发现明显的改变 。 在大鼠中，VSL-3加剧了与化学诱导性结肠炎的诱导相关的管腔物种多样性的降低，但对与粘膜相关的微生物组221无影响。 相比之下，在结肠炎相关大肠癌的小鼠模型（用乙氧基甲烷处理的Il10-/-小鼠）中，补充VSL＃3导致粘膜细菌的黏膜扩张和疣状微菌科，卟啉单胞菌和梭状芽胞杆菌的减少，这些变化与增强的致瘤性有关 。 在囊炎 患者中也观察到了与益生菌相关的微生物组调控相矛盾的结果，尽管所报道的变化可能仅源于将VSL-3细菌引入到niche223中。

安全性

• 虽然益生菌治疗或预防疾病的功效构成了长达数十年的持续辩论，但通常认为人类补充益生菌微生物是安全的，并被监管机构认可为大多数益生菌菌株 。 该安全性概况主要基于在食品中安全使用益生菌的历史以及临床试验中观察到的评估益生菌功效而不是安全性为主要指标的观察结果 。 虽然益生菌在健康的成年人中可能是安全的，但在年幼婴儿 和极低出生体重的新生儿 中，使用益生菌会增加感染和/或发病的风险。 重症监护病房的重症成年和婴儿患者; 以及术后，住院或免疫功能低下的患者，部分是由于菌血症和真菌病 。 但是，除了将血流感染的病原体作为益生菌菌株本身的试验之外，益生菌使用与感染风险增加之间的这种关联仍有待因果验证。 ·值得注意的是，对数百项益生菌试验进行的两项大规模系统评价得出结论，不良事件和安全性问题报道不多 ，要求开展非工业赞助，独立，高质量，多中心对照试验，以评估疗效和不良反应 ·在上述高危人群中，最好结合监管机构的评估 。

• 有趣的是，在对人类个体进行抗生素治疗后，益生菌菌株在结肠中的集落增加与长期持续的益生菌诱导的营养不良有关，与未进行抗生素治疗后的干预相比，粪便和胃肠道黏膜微生物组的重建显着延迟 ·。 建议从施用的乳杆菌属物种分泌的可溶性因子直接抑制（至少在体外）人类微生物组的生长 。 一致的是，另外两项试验表明，与未进行益生菌治疗相比，对个体施用抗生素后的益生菌与肠道微生物组中观察到的菌种数量较少相关 ，而第三项试验表明，益生菌对抗生素后的微生物组alpha和beta没有明显影响 ·相比安慰剂 。 重要的是，抑制微生物组数量和多样性向其抗生素前构型的重构可能导致重大的长期健康影响。 ·持续性营养不良可能会阻碍微生物组对病原体的定植抗性，这可能解释了抗生素治疗后个体使用益生菌与传染病风险增加之间的几种联系 ，并可能潜在地促进了抗生素与非传染病之间的联系， 例如1型和2型糖尿病，肥胖症，特发性关节炎，哮喘，过敏和炎症性肠病176。 ·鉴于这些观察结果，我们认为至关重要的是，在未来的临床试验中，尤其是在儿童，免疫抑制的个体和重症患者中，更好地评估益生菌在这种情况下的长期安全性。

未来发展方向

• 关于益生菌数据，个人信念，扎实证据，直觉和商业利益，再加上缺乏足够的医学规范，常常以使客观解释几乎不可能的方式混杂在一起。 尽管存在这种不幸的情况，但我们认为微生物组领域的最新发现以及新颖的高通量测序和实验技术的引入可能使我们能够重新审视关于益生菌的一些基本概念，并专注于生物学相关问题，以促进从经验性转化为益生菌。 ·以目标，疾病和患者为导向的治疗方法（表1）。 代替“黑匣子”操作方式，即随意施用一个或多个有限数量的细菌以引起健康促进作用，应采用面向机制的方法，设计益生菌制剂 临时遵循一组精心建立的标准。 这些可能包括仔细考虑要治疗的人群和要治疗的医学适应症。 ·同样，应仔细确定微生物治疗的目的，并应考虑许多问题。 对宿主的影响是通过异源细菌分泌分子，通过调节本地微生物组或通过其他假定的依赖于接触的机制将这些细菌与肠道上皮相互连接而间接或间接介导的？ ·预期的益生菌效应是菌株特异性的还是许多益生菌菌株共有的？ ·非食品级菌株是否适合解决特定的医学适应症？ ·例如，在小鼠中补充黏液曲霉可预防饮食引起的代谢综合症，并预防化学性结肠炎11。 ·Fecalibaterium prausnitzii与克罗恩病活性，IBS和结直肠癌呈负相关，并已被建议保护小鼠免受化学性结肠炎的侵袭 。 与目前可用的市售益生菌一样，加深我们对宿主及其驻留微生物组与这些潜在的新型益生菌微生物之间相互作用的理解非常重要。

表1益生菌领域的注意事项和克服这些问题的建议策略

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• 高效的益生菌治疗可能需要开发解决殖民化耐药性的方法。 ·这可以通过开发基于基线宿主和微生物组特征 评估定居潜力的预测算法来实现，并且可以使患者更好地分层进行治疗 或生成适合个体化模式的明确联盟。 其他方法可能包括合理地共同施用“益生元” ，定殖修饰剂 或为支持所施药菌株而量身定做的药物198或抵消共生抑制机制。 益生菌对宿主转录组后抗生素重组和本地微生物组构型的不利影响需要使用更多抗生素方案，益生菌菌株组合进行全面评估，并使用人类微生物组转移到无菌小鼠中进行建模，以评估潜在的长期 ·益生菌引起的营养不良的长期临床后果。 ·但是，在抗生素后的环境中，与益生菌相关的营养不良可能具有相同的潜在负面影响，在其他临床环境中可将其用作积极的治疗手段。 因此，由抗生素引起的“无生态位释放”后，益生菌的定殖明显改善，可以通过允许其在各种与微生物组相关的多因素疾病中定殖来增强益生菌的功能。 从经验丰富的“千篇一律”方案转变为针对个人和条件的方法，从本质上需要更好地理解塑造外源细菌定植的力和沿人-肠道界面对定植的抵抗力。 ·但是，在考虑到消费者安全的同时，在利用特定菌株，特定人类亚群和特定临床环境方面产生更健壮和可重复的结果方面，它可能具有希望。

• 最后，认真计划的大规模随机和盲临床试验，优先考虑缺乏商业利益，应该成为基于证据的政策制定的主体。 ·应当客观地评估和分层端点，以解决可能掩盖效应大小或混淆预期或不良结果的个体差异。 ·不良反应应得到更好的研究，报道和发表。 ·应鼓励通过治疗医师和消费者的公正公正的风险和利益评估，以改善在各种临床环境下以数据为依据的准确决策。 ·在起草或修改指南之前，应使数据易于访问和共享，以便进行全球合作以重现积极成果。 ·鉴于对于目前可用的益生菌缺乏足够的医学法规这一不幸，与其他任何人类医学干预措施一样，我们不能过分强调下一代益生菌要使用的正式法规批准程序的至关重要性。