The bone marrow microenvironment at single-cell resolution
（单细胞通量下的骨髓微环境）
文章链接：The bone marrow microenvironment at single-cell resolution
摘要
在本研究中，在体内平衡和应激诱导的造血条件下分别构建了小鼠骨髓血管，血管周围和成骨细胞群的单细胞转录组图谱。该研究揭示了骨髓龛中先前未被认可的细胞异质性水平和阐明了造血生长因子，趋化因子和膜结合配体的细胞来源。我们的研究表明，在压力条件下，包括血管周围细胞的脂肪细胞倾斜在内的骨髓龛的转录重塑相当大。应激条件下，观察到由DIl1和DIl4编码的血管Notch delta样配体基因表达下调。在无血管DII4基因存在的情况下，造血干细胞会过早地诱导髓样特征的转录进程。以上这些发现重塑了人们对骨髓龛细胞结构的认知，揭示对压力极其敏感的动力学和异质性分子图谱，同时表明单细胞转录组数据在评估离散龛细胞群体在造血功能的调节中的效用。
造血-产生成熟血细胞的过程-对于发挥各种功能至关重要，例如氧运输，免疫防御和组织重塑。这一相当大的工作由罕见的自我更新造血干细胞（HSCs）维持，该干细胞维持在由瘦蛋白受体阳性（LEPR +）的间充质基质细胞和血管内皮细胞组成的特化骨髓微环境中。先前已提出成骨细胞支持早期淋巴祖细胞存活和维持。交感神经纤维细胞，巨噬细胞，巨核细胞和非髓鞘化施万细胞提供额外的信号（细胞因子），这也有助于HSC龛。前期的研究表明，骨髓结构中存在有血管细胞和间质干细胞介导的更深程度的细胞复杂性。
必须以精确和快速的方式控制造血，来满足体内稳态和环境压力条件的不同需求。尽管我们对骨髓龛的理解在过去几十年中已经有了很大的发展，但是解决骨髓微环境的分子异质性和功能可塑性的研究仍然有限，这主要是由于骨髓中靶标细胞的数量太少及分离技术的局限性。在本研究中，我们分析了小鼠骨髓龛中的17,374个单细胞，识别出了骨髓微环境中以前未被认识到的异质性，并揭示了微环境是如何在单细胞水平对急性骨髓应激作出反应。我们将转录分析与荧光报告基因和功能研究相结合，来证明我们的单细胞研究所鉴定的Notch受体DLL4的血管表达抑制了HSC中髓样程序的过早上调。
骨髓龛的转录组学分析
为了得到骨髓龛主要的细胞亚群，作者构建了三种条件敲除的小鼠，分别标记不同的细胞类群：
VE-Cad–tdTomato标记脉管类细胞、LEPR–tdTomato标记LEPR+阳性的细胞、COL2.3–tdTomato标记成骨细胞
【The VEcad-cre;LoxP-tdTomato (VEcad is also known as Cdh5) (VE-Cad–tdTomato) model was used to label vasculature; Lepr-cre;LoxP-tdTomato (LEPR–tdTomato) was used to mark LEPR+ cells; and Col2.3-cre;LoxP-tdTomato (Col2.3 refers to cre adjoined to 2.3 kb of the Col1a1 promoter) (COL2.3–tdTomato) was used to trace osteoblasts (Extended Data Fig. 1a). 】
从酶分解消化标记的骨髓中分离出CD45和TER119低表达、tdTomato阳性的（CD45low TER119low tdTomato+ cells）细胞并进行普通测序(bulk mRNA sequencing), 结果证明存在不同的转录类群。
单细胞测序技术检测
选择VE-Cad+ , LEPR+ 与COL2.3+ 阳性的细胞进行了单细胞测序，来研究骨髓龛细胞群体的转录组多样性。分析了正常状态与氟尿嘧啶处理两种条件下的小鼠细胞。分离骨髓龛的细胞，构建10Xgenomics文库并测序。质量过滤我们获得了18339个细胞的数据。 采用比对的方法(We used an alignment method13 that was based on canonical correlation analysis (seeMethods) to correct for the observed batch effects between independent experiments (non-treated, and treated with PBS or 5-FU). We used t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE) and graph-based clustering to investigate cellular heterogeneity within the niche subsets. We removed 965 contaminating cells—most of which were haematopoietic cells—and used the remaining 17,374 cells for the analysis (see Methods) (Extended Data Fig. 2a).)
为了检测骨髓龛基准的转录组，作者仅选择状态稳定的条件的细胞（n=9622）。在作者Cre模型中，与组织特异性相关的基因表达表明骨髓龛细胞可以分成明显的亚群。
作者识别出2个内皮、4个血管周围和3个骨细胞系的细胞亚群及一个小的（含70个细胞）增殖细胞簇 (Fig. 1c, d, Extended Data Fig. 1e)。作者仅关注骨髓龛的大的细胞亚群，还可以用于其他分析（数据挖掘党的福音）。作者分别分析了内皮细胞亚群、管脉细胞亚群和骨细胞系亚群的特征和相关基因的检测。
基于整合或者独立的两种方法，从骨髓脉管系统内鉴定出两个主要的簇（聚类）。为了获得每个亚群的生物标记，作者分别对每个亚群与其他类群进行差异表分析。窦状毛细血管的分支网络构成骨髓中的大部分血管，而动脉包含相对较少的侧枝并沿着骨干纵向排列。然后是骨髓龛中血窦中的基因鉴定和检测。
鉴于LEPR+细胞群体具有多谱系分化潜能和间充质干细胞活性，该细胞群体的异质性一直是个悬而未决的问题。作者通过综合分析从LEPR+细胞群体中识别出4个明显的簇（P1、P2、P3、P4）。P1 (Mgphigh )和P2(Lplhigh ) 簇表达成脂相关的标记基因。
分析正常组的LEPR+细胞群体有明显的和3个（P1、P3和P4）簇，结合分析处理组得到P2簇（一个成脂前体细胞状态而非一个祖细胞）。P3 (Wif1high) 和P4 (Spp1highIbsphigh)为LEPR+细胞群体中成骨蓄势待发的类群，因为成骨相关的基因的表达水平随着时间日益增高。LEPR+细胞群体表达P3和P4簇的特异性基因标记CD200（由Cd200编码）和CD63（由Cd小梁63编码），该标记主要位于骨部分。
COL2.3+细胞类群可以由其转录本分为三个亚群。簇O1（Col16a1highTnnhigh）表达高水平的破骨细胞（由Ostn编码）和血管生成素样2（由Angptl2编码），以及DEL-1（由Edil3编码），其最近研究已证明其可调节骨髓细胞生成。亚群O2（Fbn1highIgf1high;扩展数据图5a）既表达成骨细胞也表达软骨细胞特异性基因。 簇O2与表面标记CD9相关。由于簇O3（BglaphighCar3high）显示出COL2.3（Col1a1）和成骨相关基因的最高表达，它代表成熟的成骨细胞（图2c，扩展数据图5a）
骨髓龛中的造血因子前体
作者从对管脉细胞亚群分析中，发现血管细胞表达最高水平的血管生成素（由Ang编码），δ样Notch配体（具体地，由Dll4和Dll1编码的那些）和选择蛋白E（由Sele编码）。在管脉细胞亚群内，动脉簇V1富含SDF-1（由Cxcl12编码）和SCF（由Kit1编码）。作者随后分析了LEPR+细胞群体和COL2.3+细胞类群中造血相关因子的表达情况（图4）。
骨髓龛的应激反应特征
常用于治疗白血病的化学疗法会导致造血祖细胞的消耗，并诱导其他静默状态造血干细胞的增殖和分化。骨髓消耗影响窦状血管和基质细胞，并导致骨髓脂肪细胞的增加。为了研究急性应激条件下骨髓龛的动态分子和形态变化，作者给予单剂量的5-氟尿嘧啶（150 mg.kg -1）。 在治疗后第5天，检测到骨髓细胞数，Lineage（Lin）-SCA-1 +CD117 +（LSK）骨髓细胞以及骨髓血管和血管周围细胞总数的显着下降。
为了追踪应激性造血过程中骨髓龛中基因表达的变化，我们用5-氟尿嘧啶处理了7,752个细胞（图3）
结果表明脂肪细胞引发的簇（P5，n = 161）（图3b，扩展数据图6d）的形成以及整个LEPR+和COL2.3+群体中簇贡献的变化。
5-氟尿嘧啶处理后的LEPR+细胞群体，脂肪相关的基因表达上调，成骨相关的基因表达下调。
5-氟尿嘧啶处理后对造血因子的影响。上调的基因有：vascular Ang, perivascular Il7 and Bmp4 and osteo Wnt5a；下调的的基因有：vascular Notch delta-like ligands Dll4 and Dll1, the adhesion molecule Sele and perivascular Wnt4。
血管内皮细胞的Notch配体
作者的分析显示Notch配体Dll1和Dll4在VE-Cad+细胞中特异性表达（图2f）。定量PCR验证Notch配体Dll1和Dll4在血管内皮细胞中高表达。并且刺激条件下Dll1和Dll4表达显著下降。之前的研究已经确定靶向造血细胞中的Notch-受体信号通路在正常造血中的关键作用。然而Notch的配体在骨髓中的作用仍不清楚。
为了检测Notch的配体在骨髓中的作用，培育了报告基因（共表达Notch配体，由Dll1, Dll4 or Jag1编码）和荧光标记的mCherry的转基因小鼠。荧光显微镜观察结果表明，Dll1和Dll4在胸腺表皮表达，Jag1在胸腺髓内表达。
通过血管DLL4表达调节HSPCs(造血干细胞和造血祖细胞)
为了进一步研究血管DLL4在正常造血中的作用，我们评估了Dll4的血管-内皮特异性缺失的影响。
我们称之为VE-CadcreER-Dll4i3COIN。 在整个VE-Cad+血管区段中Dll4缺失后，我们检测到Lin-SCA-1lowCD117lowFLT3 +IL7Rα+常见淋巴祖细胞的频率降低以及Lin- SCA-1中骨髓祖细胞群的扩增 - CD117 +FCγR+ CD34 +门（粒细胞 - 单核细胞祖细胞门），先前已报道含有混合谱系骨髓电位40-42（扩展数据图9a，b）。
讨论
越来越多的证据表明偏离了传统的造血分层模型，而是建议每个HSC能够区分不同的谱系。 很有可能假设这样的可塑性是由HSC和微环境的组成部分之间的独特相互作用决定的。 我们的研究结果通过提供骨髓龛的不同血管，血管周围和骨系组成部分的详细转录蓝图，扩展了对骨髓龛的理解。
本研究，结果表明单细胞转录组分析可以转化为机制明了干细胞和祖细胞分化的调节。 作者将造血因子与其细胞来源相匹配，并显示血管-内皮细胞表达的Notch配体DLL4的缺失使骨髓造血倾向于HSPC的显著的转录重编程和髓样发生。 将来的研究需要研究骨髓龛异质性对功能异常干细胞的影响，如免疫缺陷，造血系统恶性肿瘤和衰老。 靶向骨髓龛相关因子可能干扰疾病的发生和发展，最近已经有研究通过靶向急性淋巴细胞白血病中的血管CXCR4-CXCL12相互作用显示出来。
