今天小编带来一篇发表在Nature上的胶质瘤相关的文章解读。该文章利用单细胞转录组技术找到了一群独特的肿瘤细胞亚群，并利用GeoMx DSP空间转录组检测技术确认了这群特殊肿瘤细胞在大脑组织中的空间位置分布。在这篇文章中，我们可以看到研究者是如何发挥单细胞和空间转录组技术的优势，并将两种不同技术的结果巧妙地串联在一起，从而解析神经元活动促进胶质瘤进展的分子机制。
文章详情
文章题目：Remote neuronal activity drives glioma progression through SEMA4F
中文题目：远端神经元活动通过SEMA4F驱动神经胶质瘤进展
发表时间：2023.07
期刊名称：Nature
影响因子：69.504
实验平台：10x Genomics 单细胞转录组测序+GeoMx DSP空间转录组等技术
DOI：10.1038/s41586-023-06267-2
01 研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）是最具有侵袭性和致命的脑肿瘤，增殖率和对周围脑组织的浸润率高，易复发。GBM浸润通常沿着血管和白质束，这些组织中包含神经元轴突，暗示了神经元可能参与肿瘤的浸润。前人的研究已发现神经元活动可以促进肿瘤浸润和发展，但是神经元活动是否通过旁分泌信号促进GBM以及驱动GBM浸润的潜在分子机制尚不清楚，并且大脑中含有大量神经元亚型，哪些亚型可驱动GBM进展也有待探究。
02 技术路线
为了解决上述问题，本研究主要使用的研究方法和分析思路如下：
1.构建GBM小鼠模型，刺激原发癌对侧神经元激活，并利用荧光监测肿瘤的浸润情况，从而确认对侧神经元活动是否能够影响肿瘤的浸润和进展。同时，结合数学模型和体外实验，确认对侧神经元的旁分泌因子与肿瘤浸润的关系。
2.通过切断胼胝体，或者选择性激活对侧脑神经元，以确认可能影响GBM浸润和进展的神经元亚型。
3.利用单细胞转录组测序技术，确认GBM组织中肿瘤细胞在对侧神经元活动的刺激下发生了怎样的变化，并使用DSP空间转录组技术，确认这种变化的空间位置。
4.利用barcode screen技术筛选与GBM进展和浸润相关的候选基因，并通过生存分析、过表达和敲除实验确认候选基因功能，从而鉴定到目的基因。
5.对目的基因过表达的肿瘤组织进行单细胞转录组测序，以确认该基因是否能产生与对侧神经元活动刺激后相同的肿瘤细胞变化。随后，利用富集分析确认目的基因过表达后肿瘤细胞富集的信号通路。由于富集到的信号通路和目的基因家族都与突触形成相关，因此研究者使用脑电图检测确认突触重塑的方向。
03 研究结果
1. 远端神经元活动可驱动GBM进展
刺激GBM小鼠原发区域对侧的神经元活动后发现，刺激组的总生存期（OS）中位值与对照组相比显著减少、Ki67上调表达，并出现了高级别肿瘤的典型病理特征。这些结果表明对侧神经元活动的刺激可促进低级别肿瘤向高级别肿瘤方向发展。随后，使用基于CRISPR-Cas9的子宫内电穿孔（IUE）模型进行研究。该模型中，GBM始发于单侧大脑皮层，然后渗透穿过胼胝体到达对侧半球。研究结果表明，对侧神经元活动刺激可加速肿瘤的浸润，上调Ki67的表达，而刺激同侧神经元虽然可以增加肿瘤增殖，但肿瘤浸润无显著变化。最后，通过数学建模分析，发现与对照组相比，刺激组的肿瘤浸润宽度相比于肿瘤质量增加。体外实验则证实，用含有患者自发激活神经元的皮层样品制备的培养基处理GBM球后促进了GBM的浸润。综上所述，这些结果表明神经元活动可通过分泌因子促进肿瘤的浸润，而原发癌对侧的神经元在进展的早期阶段可促进这一现象。
2. CPNs促进GBM的进展
因为胼胝体投射神经元（CPNs）的轴突可沿着胼胝体横跨皮层半球，因此研究者猜测是CPNs促进肿瘤浸润。为了验证这一猜想，研究者首先切断了胼胝体，并发现对侧神经元活动刺激后的肿瘤浸润加速现象消失。当选择性激活对侧L2/3层神经元后（约80%的CPNs位于L2/3层），发现肿瘤浸润水平增加，与全神经元激活时相当。这些结果表明，对侧CPNs在推动肿瘤进展方面发挥关键作用。
3. 活动依赖性胶质瘤细胞亚群
单细胞转录组测序发现一群肿瘤细胞亚群，主要存在于对侧神经元活动刺激的GBM中。对该亚群GO富集分析鉴定到 glutamatergic synapse和axon guidance。利用DSP空间转录组检测技术鉴定到这个活动依赖性胶质瘤细胞亚群的marker基因主要表达在原发癌对侧的浸润性肿瘤细胞中。前沿细胞也富集到了与axon guidance相关的基因。在IVY-GAP数据库中，这种浸润性特征在人GBM的前沿区域也有类似而高度特异的富集。综上所述，神经元刺激驱动了浸润性细胞群的产生，而这些细胞群对应于胶质瘤肿瘤的前沿区域。
4. SEMA4F引导神经胶质瘤进展
使用barcode screen技术从43 个axon guidance基因中进行筛选，发现SEMA4F、EPHA6和EPHA7富集在对侧区域和IVY-GAP数据库中的肿瘤前沿区域。结合过表达/敲除实验，发现SEMA4F的过表达减少了OS，并增强肿瘤的浸润，敲低后则会产生相反的结果。为了确定SEMA4F是否通过细胞外机制对胶质瘤有贡献，研究者过表达了SEMA4F的胞外域，发现可促进肿瘤的浸润和增殖，并且在SEMA4F敲除肿瘤中过表达该基因胞外域可挽救由于敲除导致的肿瘤增殖和浸润缺陷。这些结果表明，SEMA4F通过其外胞域介导了活动依赖性的胶质瘤进展，并通过与脑微环境的相互作用促进了肿瘤浸润，暗示它通过与脑部微环境的相互作用调节了这一现象。
5. SEMA4F促进大脑过度活跃
对SEMA4F过表达肿瘤进行单细胞转录组测序，发现活动依赖性的肿瘤细胞亚群也富集在过表达肿瘤中，并且包含axon guidance基因，进一步分析发现肿瘤细胞中的几个突触信号通路上调，包括glutamatergic synapse基因。对SEMA4F过表达的人胶质瘤细胞的Bulk RNA测序也富集到突触信号和axon guidance通路。前人研究发现Sema家族成员和它们的PlexinB受体可以引发突触形成，结合该基因胞外域在肿瘤进展中的作用，促使研究者评估SEMA4F过表达肿瘤周围神经元中的兴奋性/抑制性突触，以及突触重塑方向。结果表明，抑制性突触减少，兴奋性神经元增加，SEMA4F通过突触重塑促进了脑网络高活跃性。上述结果暗示SEMA4F自身驱动了这一活动依赖性浸润性胶质瘤细胞亚群的产生。
04 主要结论
本研究发现位于原发性GBM对侧半球的胼胝体CPNs促进肿瘤进展和广泛浸润，并鉴定到了存在于人和小鼠肿瘤前沿的活动依赖性浸润肿瘤细胞亚群，富集了axon guidance基因。对这些基因的体内高通量筛选确定SEMA4F是肿瘤发生和活性依赖性进展的关键调节因子。此外，SEMA4F 通过将肿瘤相邻突触重塑为脑网络过度活跃状态，促进活动依赖性浸润群体并传播与神经元的双向信号。这些结果表明，远离GBM的神经元亚群促进了恶性进展，并揭示了由神经元活动调节的胶质瘤进展新机制。
参考文献：
Huang-Hobbs, Emmet et al. “Remote neuronal activity drives glioma progression through SEMA4F.” Nature vol. 619,7971 (2023): 844-850.
