构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。在构建 lncRNA 表达质粒时，需关注 lncRNA 是否在蛋白编码基因的启动子区域或 3′-UTR 区域，勿遗漏重要区段。

引物设计是载体构建的第一步，也是最关键的一步，这直接决定了后续实验能否进行下去。引物设计完成后的具体操作步骤见后文。文章正在审核中... - 简书

整体操作：

1.    选择合适的载体，依据实验室现有的条件进行选择：plvx-puro，Amp，puro，其他慢病毒载体的原理相似，例如pLenti-puro等

2.    找到基因的CDS区，复制；对于LncRNA，则直接选择全部序列即可

3.    用primer5找到目的基因上没有and载体有的酶切位点

4.    确定酶切效率，在酶边是否需要加保护碱基以提高效率

5.   Kozak序列（针对表达蛋白的载体，而对于L过表达载体，则不需要RNA）

6.   取目的基因CDS区两端15~21个碱基（或反向互补链），加上酶切位点和kozak。当然，这个范围可以放宽。

操作步骤：

一 扩充全长

①  在NCBI找到基因序列，复制ORIGIN区。

②  打开primer5软件，将序列复制到到中间的框内

③点击Enzyme

点击OK，得到该基因所包含的酶切位点数据。

④ 分析载体质粒的酶切位点，这里用pLvx-puro作为目的基因的载体

因此，BamH1、EcoR1不可使用，其他可用的有：

Xho1、BsyB1、Apal、Smal、Xbal

酶切的选择还需要考虑现实情况，我们组内有现货的酶：Xho1, Xbal。

在目的基因的上下游截取15-21bp序列，点击Primers里的Add primers,根据经验选取Tm值在50-60℃左右，在上述范围内选取合适的bp。

选择“引物”，“添加引物”，先设计上游引物：输入上游18bp碱基后，再插入XhoI位点：

得到CTCGAGGCTGCTGCCACGTAAGAA

再设计下游引物：因下游3’端有连续22个A，若算入，则Tm值和GC含量均不达标。因此，在引物设计时，去掉尾部部分A序列，输入尾部序列，点击“反向互补序列”，插入XbaI位点，得到TTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT，Tm=50℃。

查找保护碱基，随便百度都能搜到。

①因此XhoI酶切位点处的上游引物为：对于LncRNA来说，不需要起始密码子，不需要Kozark序列，但是需要防止误翻译。

保护碱基+酶切位点+一小段目的基因

CCGCTCGAGCGGGCTGCTGCCACGTAAGAA，67%GC,Tm56℃

②XbaI酶切位点对应的下游引物为：

保护碱基+酶切位点+一小段目的基因

若是加上A尾，GCTCTAGAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTGACTTTGTGTT

若是不加A尾GCTCTAGAGCTTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT。

二 分片段扩充后再连接

对于一些过长的基因来说，直接通过两端的上下游引物，是无法扩出合适的cDNA的，因此可以选择将基因分段扩增，再进行连接。

例如up主所研究的基因是6810bp，之前已经合成了1-3010长度的质粒，因此现在只要合成后半部分，再进行DNA连接即可。

因为本组已有一个1-3010，两端酶切位点分别为BamHI和XhoI的pcDNA3.1载体，因此可以设计从3011开始，以XhoI作为末端的上游引物：CCGCTCGAGCGGAAAATTAGGTTTATTCAAGC。

因此，可将pcDNA3.1-AFAP1-AS1以BamHI/XhoI做酶切得到1-3010片段，

以引物扩增后的cDNA以XhoI和XbaI做酶切即可得位点为XhoI/XbaI的3011-6810片段，再连接在一起可得全长full-length序列，位点为BamHI/XbaI。

再将plvx载体以BamHI和XbaI做酶切，与上述cDNA相连，即可得出plvx-AFAP1-AS1-full-length。

详细的载体构建的操作步骤、注意事项等，可见于载体合成步骤 - 简书

对于其他过长的载体，建议各位可以采取类似的方法，分段酶切、再连接。这时要注意引物的选取。

接后续：阿婆主的6800bp载体做成了，直接从细胞的RNA里扩全长没成功，估计是因为实在太长了！

后面试了，分成了3000+3800两个片段来做，可成功！！！