hello，大家好，上一篇文章空间转录组检测靶点定量技术----Digital Spatial Profiler（DSP）中分享了DSP的技术原理以及简单的文献分享，但是我们真正了解这个技术的实际运用，还是要多看看高分文献的使用方法以及结果解读，今天呢，我们就来分享一下DSP的实际运用的文献，帮助我们深入理解数字化空间

今天分享的文献是Visualizing in deceased COVID-19 patients how SARS-CoV-2 attacks the respiratory and olfactory mucosae but spares the olfactory bulb，2021年11月3号被cell接收，顶级期刊，这样级别的文章运用，值得我们的好好研究。

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SUMMARY

Anosmia，即嗅觉丧失，是 COVID-19 的常见症状，而且通常是其唯一症状。 导致嗅觉功能障碍的一系列病理生物学事件的发生仍然不清楚。 在这里，作者开发了一种死后床边外科手术，以通过内窥镜采集呼吸和嗅觉粘膜以及整个嗅球的样本。 作者的 85 例病例队列包括在感染 SARS-CoV-2 几天后死亡的 COVID-19 患者，这使能够在病毒仍在复制时捕获它。 研究发现sustentacular cells是嗅粘膜中的主要靶细胞类型。 研究未能找到嗅觉感觉神经元感染的证据，嗅球的实质也幸免于难。 因此，SARS-CoV-2 似乎不是嗜神经病毒。 研究假设来自sustentacular cells的短暂支持不足会在 COVID-19 中引发短暂的嗅觉功能障碍。 嗅觉感觉神经元会受到影响而不会被感染。

INTRODUCTION

嗅觉功能障碍在 COVID-19 大流行的早期就被发现，并且是与 COVID-19 检测呈阳性相关的强烈且一致的症状。 进入大流行的第二年，对于 SARS-CoV-2 如何mutes或改变嗅觉，尚无任何解释。 一个悬而未决的问题是嗅觉神经是否可以为 SARS-CoV-2 提供进入大脑的途径。

在 SARS-CoV-2 进入scene后不久，病毒细胞侵入基因 ACE2 和 TMPRSS2 在人和小鼠嗅觉系统中的表达模式就得到了表征。 得出的推论是sustentacular cells而不是嗅觉感觉神经元 (OSN) 可能是嗅觉上皮 (OE) 中的易感细胞类型。 但是，令人费解的是，其他六种冠状病毒中的两种，SARS-CoV 和地方性 HCoV-NL63，也使用 ACE2基因进入细胞，但通常不会引起嗅觉功能障碍。 SARS-CoV-2 在 COVID-19 患者的sustentacular cells中的复制仍有待证明。

Historically，对正常和患病人类嗅觉粘膜 (OM) 和嗅球 (OB) 的组织学和分子研究很少。从在世和已故的患者身上采集质量合适且身份明确的样本已被证明是有问题的。宏观上不能将 OM 与呼吸道粘膜 (RM) 区分开来。从解剖学上讲，OM 由一系列大小不一的islands组成，这些islands散布在 RM 中，位于嗅觉裂隙内鼻腔的高处。与实验室啮齿动物的 OM 相比，人类 OM 不是一个uniform sensory sheet。在人类 OE 中，Patches of aneuronal epithelium are intercalated with patches containing abundant OSNs in human OE。 OM 由 OE 和固有层 (LP) 组成，这两层由基底层紧密结合在一起。简单地说，不可能采集到纯人类 OM 的样本，更不用说纯人类 OE 的样本了。 此外，由于颅内位置和干预的虚弱后果，不能从活着的患者身上进行 OB 活检。在传统的尸检环境中采集 OM 和 OB 通常只有在长时间的尸检间隔 (PMI) 后才可行，尤其是在可能仍具有传染性的 COVID-19 患者中。长期 PMI 后采集的样品分析因细胞和组织自溶导致的限制而变得模糊不清。

作者推断，为了大幅降低 PMI，最好在死后不久在床边进行组织采集。 进一步推断，为了研究导致嗅觉功能障碍的病理生物学事件序列是如何开始的，研究设计必须考虑将患者纳入感染的急性期，使我们能够在病毒袭击时捕捉到病毒。

在这里，作者开发了一种死后床边外科手术，改编自颅底手术的内窥镜技术，以采集 RM 和 OM 组织样本和整个 OB。 通过将超灵敏单分子荧光原位 RNA 杂交的 RNAscope 平台与荧光免疫组织化学 (IHC) 相结合，可视化了 SARS-CoV-2 如何攻击嗅觉系统。 将 RM 中的纤毛细胞和 OM 中的sustentacular cells鉴定为鼻粘膜中 SARS-CoV-2 复制的主要靶细胞类型。 一部分病例显示在 OB 周围的软脑膜层中存在病毒 RNA，但 OB 实质不受感染。 缺乏 OSN 和 OB 神经元感染的证据表明 SARS-CoV-2 不是嗜神经病毒。 文章假设受感染的sustentacular cells短暂地为 OSN、结构和/或生理提供了不足的支持。

RESULTS

Postmortem bedside surgical procedure

我们设计了一个 24/7 工作流程，由重症监护病房 (ICU) 或病房的医护人员在 COVID-19 患者死亡后不久致电耳鼻喉 (ENT) 医生团队发起

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耳鼻喉科团队穿着个人防护设备，在死者的床上使用由监视器、光源、相机和内窥镜设备组成的预组装移动装置进行内窥镜手术。 这个概念是一项名为 ANOSMIC-19 的临床研究的基础，分析 COVID-19 中的嗅觉障碍机制。 我们纳入了 68 名在 2020 年 5 月至 2021 年 4 月期间在鲁汶大学医院或 Sint-Jan Brugge-Oostende AV 综合医院死于或死于 COVID-19 的患者队列。同时，我们纳入了 15 名对照患者和 2 名康复期 COVID-19 患者，他们在康复几个月后在医院死亡。 我们的 COVID-19 病例队列代表了已故 COVID-19 患者相当统一的表型：主要是患有多种合并症的男性，最常见的是肥胖或超重、2 型糖尿病和高血压。

We adapted the postmortem bedside surgical procedure from the endoscopic endonasal transcribriform approach in skull base surgery。 简而言之，为了采集 RM 的样本，用 Heymann 鼻剪刀分别切除了鼻腔的下、中和上鼻甲骨。

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接下来，为了采集 OM 的样本，dissected the lining of the olfactory cleft including the superior part of the septum and the cribriform plate with a sickle knife, while transecting the fila olfactoria

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随后，用锤子和凿子代替钻头去除了前颅底的骨性部分，避免在这些患者中形成气溶胶，其中一些患者可能仍然具有传染性。 在对硬脑膜进行纵向切口后，使用球形探针将 OB 从大脑的上覆部分分离，确保组织的无损伤去除，并尽可能向后从嗅束中横切 OB。

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We performed the procedure on the left and right nasal cavity, and the identical procedure on control patients.

总之，我们大幅降低了 PMI：COVID-19 ICU 患者的中位数为 67 分钟，COVID-19 病房患者为 85 分钟，对照患者为 89 分钟。（这取样过程真的是相当复杂，难度极高，也很有危险性）。

Combining ultrasensitive in situ RNA hybridization with immunohistochemistry

研究推断，RNA 病毒的靶细胞类型的可视化应该首先通过 RNA 原位杂交进行。 选择了 RNAscope 技术，它将单个 RNA 分子可视化为一个点或“punctum”，复数“puncta”。 荧光 RNAscope 可与荧光 IHC 结合使用，后者将抗原可视化为免疫反应 (IR) 信号。 IR 信号通常会漫漫地填充细胞，从而勾勒出其轮廓，便于细胞类型识别。

下图显示了对照患者中 RM、OM 和 OB 的冷冻切片图像。 通过结合 RNA（斜体名称）和蛋白质（罗马名称）标记的表达、它们的形态和它们在组织中的位置来识别细胞类型。 RM 排列在鼻腔的大部分内表面(下图A)

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假复层呼吸上皮 (RE) 由厚的基底层从 LP 划定。 RE的主要细胞类型包括纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞。 FOXJ1 编码一种参与纤毛发生的转录因子，是纤毛细胞的标志物，纤毛不断将覆盖的粘液扫到鼻咽部。 EPCAM 是一种细胞粘附分子，可标记 RE 中的纤毛细胞和 LP 中产生粘液的腺体及其导管。 粘蛋白 MUC5AC 是一种保护 RM 的凝胶形成糖蛋白，是杯状细胞的标志物，并且 MUC5AC-IR 信号还可以识别分泌的粘液团块。 OM 是鼻粘膜的次要成分 （上图B）。假复层 OE 的主要细胞类型是处于不同成熟阶段的 OSN、非神经元支持细胞或支持细胞，以及基底细胞，它们是在个体的整个生命过程中再生 OSN 和支持细胞的干细胞。在顶端，成熟的 OSN 长出纤毛，而支持细胞则长有微绒毛。支持细胞可以通过包括细胞角蛋白 KRT8 在内的几种标记来识别，它们的形态和在 OE 中的位置是特征性的：它们跨越 OE 的顶端 - 基底宽度，它们在顶端形成一个没有细胞核的层，并且在底部它们逐渐变细并延伸足部加工到薄的基底层，从 LP 描绘 OE。成熟 OSN 的经典标记是嗅觉标记蛋白 (OMP)。成熟的 OSN 被认为仅表达 389 个基因库中的一个完整的气味受体 (OR) 基因。图中显示一个 OSN 带有 OR5A1 的斑点，它是 β-紫罗兰酮的主要受体，是食品和饮料中的一种关键香气。 OR 基因的斑点呈现出类似于樱桃形状的特征模式。

OB 位于颅腔内（上图C）。它接收来自fila olfactoria 的同侧输入，这是一束OSN 轴突，它们穿过筛状筛板上的几十个孔。 TUBB3 是微管的组成部分，是神经元和轴突的经典标志物。 TUBB3-IR OSN 轴突在 OB 中合并成肾小球。 OB 的表面被软脑膜紧密覆盖，软脑膜薄层是 SSTR2A 的 IR，生长抑素受体 2。另一个软脑膜层是蛛网膜，一种蜘蛛网状结构，与硬脑膜相连，硬脑膜是坚硬的外层 靠近颅骨的脑膜层。 脑脊液在软脑膜和蛛网膜之间不断循环。

In summary, our rapid approach of tissue sample procurement allowed us to generate, from 100% of cases, high-quality confocal images combining RNAscope with IHC.

Viral RNAscope probes and antibody

SARS-CoV-2 是一种正链单链 RNA 病毒。 在病毒生命周期中产生负义全长复制中间体和多个负义亚基因组 RNA。 负义 RNA 反映了正在进行的病毒复制，并且不存在于病毒粒子中。 使用了一组七个 RNAscope 探针：SARS-CoV-2-N（核衣壳，以下简称为 N puncta）、SARS-CoV-2-S（尖峰；S puncta）、SARS-CoV-2- M（膜；M puncta）、SARS-CoV-2-orf1ab（开放阅读框1a和1b；orf1ab puncta）、SARS-CoV-2-N-sense（N-sense puncta）、SARS-CoV-2-S -sense (S-sense puncta) 和 SARS-CoV-2-orf1ab-sense (orf1ab-sense)。 有义探针检测负义 RNA，在核周出现斑点。 我们还使用针对核衣壳的抗体进行了 IHC。

SARS-CoV-2 infects ciliated cells in the respiratory epithelium（SARS-CoV-2感染呼吸道上皮的纤毛细胞 ）

为了为检查嗅裂黏膜样本提供合适的背景，首先检查了 RM 样本

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在 68 例 (44%) COVID-19 病例中的 30 例 RM 中检测到病毒存在。 此后，将此subset称为“信息性”案例。 他们在通过逆转录、定量聚合酶链反应（以下简称 PCR）诊断出 COVID-19 后 16 天内死亡，但 COVID #29 除外，后者是实体器官移植的免疫抑制受体，在诊断后 29 天死亡.没有在其他 38 个（“非信息性”）COVID-19 病例、两个康复期 COVID-19 病例和 15 个对照病例的 RM、OM 或 OB 中检测到 SARS-CoV-2 puncta。 对于 COVID #9 至 #70，我们对手术前通过内窥镜检查的鼻咽 (NP) 拭子进行了快速抗原测试（视频 S1 于 0’31”），发现与 RNAscope 数据高度一致。 对于 11 例 COVID-19 病例，我们在术前采集的第二个 NP 拭子上获得了 PCR 数据。

我们在 30 个 (90%) 信息丰富的病例中的 27 个 RM 中将纤毛细胞确定为 SARS-CoV-2 的主要靶细胞类型，在 4 个 (13%) 中确定了 LP 中衬里腺管的细胞。

下图显示了控制案例 #12 的 RM 部分的共焦图像。 纤毛细胞弥漫着 KRT7-IR 信号并带有 FOXJ1 斑点，而细胞角蛋白 KRT5/6 的 IR 信号标记细胞的基底层，从 LP 中勾勒出 RE，EPCAM-IR 标记上皮细胞，MUC5AC-IR 信号标记产生粘蛋白的细胞并识别粘液斑点。 ACE2-IR 信号在 RE 的管腔表面形成不连续的薄带，并且整个 RE 中 TMPRSS2 的斑点比比皆是。

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在 COVID #7 的 RE 中，核衣壳-IR 信号弥漫地填充一排不间断的顶端细胞（下图）

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该患者的感染时间线非常明确，他在诊断后 78 小时死亡，之前 3 天和 6 天采集的 NP 拭子的两个 PCR 结果呈阴性。 与感染的急性期一致，核衣壳-IR 细胞具有核周 orf1ab 感点。 COVID#7（下图F）中核衣壳 IR 细胞中具有 orf1ab 感点的核周 N 感点cluster和 COVID #27 中密集排列的 orf1ab 点（下图G）。 在 COVID #51 中，具有 M 和 FOXJ1 斑点的核周 Nsense 斑点cluster（下图H）。 在 COVID #39 中，单个纤毛细胞内具有 FOXJ1 点的核周 orf1ab 感点cluster(下图I)

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COVID#7 中 KRT7-IR 细胞中具有 FOXJ1 点的核周 S 感点cluster（下图J）。在 30 个提供信息的病例中，有 4 个病例感染了 LP 腺管内衬的细胞。 在 COVID #29、#63 和 #67 中，只有导管被感染，而在 COVID #60 中，RE 和导管都被感染。 LP 腺管内衬的 KRT8-IR 细胞在 COVID#29（下图K）和 COVID#63（下图L）中含有密集的 N 点和 orf1ab 感点。

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最初将 COVID #63 作为对照病例，在死亡前 82 小时采集的 NP 拭子的 PCR 结果为阴性，但在我们死后采集的拭子上检测为 PCR 阳性。 在我们的队列中，COVID #63 从诊断到死亡的时间最短。

In summary, the RM is a major site of infection for SARS-CoV-2 and represents a vast area of cells susceptible to virus entry and replication.Ciliated cells are the major target cell type in the RE, and in a subset of patients, cells lining gland ducts in the LP are infected.

Post-hoc scoring of infection with B.1.1.7/Alpha vs non-B.1.1.7/non-Alpha

In late 2020, Variant of Concern B.1.1.7 made its entry into the SARS-CoV-2 landscape in Belgium, and rapidly took over to become the dominant lineage during the third wave of the COVID-19 pandemic in Belgium. Later known as the Alpha variant, B.1.1.7 is characterized by a higher transmissibility and higher viral load. A 6-nucleotide deletion in S encoding the amino acids HV is specific for the Alpha variant, and a 9-nucleotide deletion in orf1ab encoding SGF of the non-structural protein nsp6 is present in the Alpha, Beta, and Gamma variants. We designed a chromogenic assay with custom probes for BaseScope, a version of the RNAscope platform specific for subtle mutations.

我们获得了 35 个 COVID-19 病例的关注变体特异性 PCR 或序列数据，其中包括 COVID #60（感染了非 Alpha 谱系）和 COVID #68（感染了 Alpha）。 在 COVID #60（诊断后 40 小时死亡的患有活动性肿瘤疾病的患者）的 RE 中，一小部分含有 FOXJ1 斑点的细胞被核衣壳-IR 信号弥散填充，并且这些细胞中的大部分含有核周 orf1ab 感斑点。 在 COVID #68（诊断后 5 天死亡的患有活动性肿瘤疾病的患者）的 RE 中，核衣壳-IR 细胞中具有 FOXJ1 点的核周 S 感点cluster

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针对 S 的野生型或缺失形式的两种 BaseScope 探针的混合分别在 COVID #60 或 COVID #68 的 RE 中产生了蓝绿色或红色沉淀物。 用于 orf1ab 的野生型或缺失形式的两个 BaseScope 探针的混合支持这种二元基因分型。

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In summary, we have developed a post-hoc assay for differential diagnosis of infection with Alpha vs. non-Alpha lineages in fixed tissue samples.

SARS-CoV-2 infects sustentacular cells in the olfactory epithelium

接下来，我们分析了来自嗅裂黏膜的样本。 我们面临的挑战是 OM 岛分散在 RM 中并包含 OSN 稀疏甚至不存在的 OE 区域。 我们通过神经元标志物的表达严格定义了“OM”，包括 ANO2、CNGA2、GNAL、GNG13、OMP 和 OR 基因的斑点以及 TUBB3-IR 信号。 我们在 30 个（20%）信息丰富的病例中的 6 个的 OM 中检测到 SARS-CoV-2 斑点和核衣壳-IR 信号。 我们将支持细胞确定为 OE 中的主要靶细胞类型，但未能找到 OSN 感染的证据。

下图A 和 下图B 显示了控制案例 #4 的 OM。 支持细胞弥漫地充满 KRT8-IR 信号并带有 TMPRSS2 斑点，四个相邻的 OSN 带有斑点，用于 OR 基因 OR5A1、OR5AN1、OR7C1 和 OR11A1 的探针池（图 5A）。 ACE2-IR 冠状条纹覆盖了一系列相互交织的 KRT8-IR 支持细胞和 TUBB3-IR OSN

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COVID #22 的图像在诊断后 26 天死亡，并且在任何组织样本中都没有检测到 SARS-CoV-2 斑点，展示了 OE 的三种主要细胞类型

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GPX3 的 Puncta 编码谷胱甘肽过氧化物酶，标记 LP 中从顶端到基底和鲍曼腺细胞的支持细胞。 ANO2 的 Puncta 编码嗅觉信号转导通路中的氯通道，标记 OSN 的中间层。 KRT5/6-IR 信号标记细胞的基底层。

一个信息量很大的案例是 COVID #8，他在诊断后四天死亡。 TUBB3-IR 细胞 (OSN) 不包含核衣壳-IR 信号，并且支持细胞具有 UGT2A1 斑点。 N puncta 弥漫性地填充了许多从顶端到基部的 OE 宽度的支持细胞；有趣的是，KRT8-IR 信号识别了一块未感染的支持细胞，而受感染的支持细胞对 KRT8-IR 信号来说是低的或阴性的。 N 泪点密集地堆积在细胞中，具有典型的支持细胞形状（类似于酒杯，带有扭曲的茎接触基底层），受感染的支持细胞的较宽顶端部分与含有 UGT2A1 点和未感染的支持细胞的那些混合在一起。 ERMN 的 IR 信号为上限，ERMN 是一种支持细胞标记物。对于给定标记物，受感染的支持细胞的斑点或 IR 信号低或呈阴性，这与 SARSCoV-2 引起的宿主 mRNA 衰变和宿主蛋白质翻译的抑制一致。这种多管齐下的病毒接管可以通过单个受感染的支持细胞在未感染的支持细胞中脱颖而出来说明：该细胞没有 GPX3 点，从顶端到基底弥漫性地充满核衣壳-IR 信号，并含有核周 orf1ab 感点。

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我们详尽地搜索了 OSN 中 puncta和核衣壳-IR 信号的存在，但未能找到。 作为否定证据的例子，S-sense puncta 与 KRT8-IR 信号一起出现在顶端层，而四个 OR 基因探针池的 puncta 出现在中间层。 高倍放大图像显示，带有探针池点的 OSN 不包含核周 S 感点。 含有 S-sense puncta 并含有 KRT8-IR 信号的顶端层与含有探针池的 puncta 的 OSN 的中间层是相互排斥的。 带有 OR 基因 OR7C1 斑点的单个 OSN 及其周围的几个 TUBB3-IR 细胞不含有 S-sense puncta。

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我们在另一个案例 COVID #7 中证实了这些观察结果。 我们确定了具有 CNGA2 斑点和 TUBB3-IR 信号或 GNAL 斑点的 OSN。 在含有 SOX2 斑点的几个未感染的支持细胞中，有两个细胞含有核周 orf1ab 感斑点。 由于 KRT18-IR 信号的消耗，含有密集 N 点的支持细胞脱颖而出。 在 COVID #57 和 COVID #25 中，受感染的 OE 受损，大量组织脱落； 它很可能处于脱屑的边缘。

In summary, sustentacular cells are the major target cell type in the olfactory mucosa. We failed to find evidence for infection of OSNs. The pattern of infection of the OM is patchy.

Spatial whole-transcriptome profiling of the olfactory epithelium of COVID #8(说了这么老半天才到DSP)

在感染的急性期，sustentacular cells的感染是否会对 OSN 中的 OR 基因表达产生间接影响？ 为了解决这个假设，我们利用 GeoMx 数字空间分析（DSP）和整个转录组图谱 (WTA) 来获取 18,318 个人类转录本。

由于大量成熟的 OSN、几毫米长的 OE 连续延伸以及感染斑块的几何特征，COVID #8 最适合此分析。 我们分析了一张载玻片与 COVID #8 的 OM 的六个相邻切片。载玻片用 RNAscope 探针对 S 和 IHC 进行荧光染色，用于 KRT8/18 和 pan-KRT。 然后将载玻片与 WTA 探针和 orf1ab 和 S 的spike-ins 杂交。根据来自 S puncta 的荧光信号强度的视觉引导，我们在 OE 中选择了 17 个感兴趣区域 (AOI)：10 个具有高病毒载量（ ORF1ab 高）和 7 病毒载量低（ORF1ab 低）

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放大显示了两个 AOI：AOI 13 在 25,741 μm² 的区域内包含 414 个原子核，AOI 7 在 38,994 μm²的区域内包含 420 个原子核.

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两种类型的 AOI 之间的核数没有显着差异

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每个 AOI 都单独进行紫外线照射，以光裂解 WTA 探针以进行收集和测序。 ORF1ab 高与 ORF1ab 低 AOI 中 orf1ab 的标准化表达计数与我们对共聚焦扫描的视觉判断非常吻合

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The S and orf1ab counts have a Pearson’s correlation coefficient of 0.998

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在至少 20% 的 AOI 中检测到的 9,262 个基因的差异表达模型显示，在 ORF1ab 高 AOI 中，支持细胞标记 GPX3、KRT8 和 KRT18 的标准化表达计数显着减少，而 OSN 标记 ANO2 和 GNG13 的标准化表达计数显着增加

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当包括富含 ORF1ab 高 AOI 但具有较大 p 值的标记基因时，八个sustentacular 细胞标记（-0.80，SD = 0.30）和八个 OSN 细胞标记（0.69，SD = 0.26）的 log2 倍数变化 (FC) 的平均值 大小相同但方向相反

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After flipping the sign of the FCs for sustentacular cell markers，没有拒绝与 OSN 标记的 FC 的大小没有差异的零假设（t 检验：t = -0.84，df = 13.7，p 值 < 0.4154）。 换句话说，AOI 的两种主要细胞类型的 FC 值是反相关的。 检测到的 26 个 OR 基因的 log2 FC 的平均值 (0.66, SD=0.64) 与 8 个 OSN 细胞标记的 log2 FC 的平均值没有显着差异（t 检验：t = -0.14，df = 29.321，p 值 < 0.89）

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Reassuringly, the four OR genes OR5A1, OR5AN1, OR7C1, and OR11A1 for which we had identified numerous cells in adjacent sections by RNAscope were among the 26 OR genes detected by WTA profiling.

In summary, the intra-slide approach of spatial whole-transcriptome profiling revealed no changes in OR gene expression levels in OE patches of high vs. low viral load in COVID #8.

SARS-CoV-2 can make it to the leptomeningeal layers surrounding the olfactory bulb but spares its parenchyma

与缺乏 OSN 感染的证据一致，我们未能找到病毒侵入 OB 实质的证据。 令人惊讶的是，我们在 30 个 (37%) 信息丰富的病例中的 11 个中发现了围绕 OB 的软脑膜层内的病毒 RNA

在 COVID #16（患有活动性肿瘤疾病，诊断后 8.5 天死亡的患者）中，整个 OB 矢状切面的平铺共聚焦图像显示标记软脑膜和蛛网膜的 SSTR2A-IR 信号和 TUBB3-IR 信号 标记传入的 OSN 轴突和 OB 神经元

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高倍放大图像显示软脑膜靠近 OB 的一侧有 N puncta

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在同一 OB 的相邻部分，在软脑膜的一段内出现密集的 N 点，并伴有丰富的核衣壳-IR 信号，这种组合可能反映游离病毒粒子，但不在 OB 实质中

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在另一部分中，S puncta出现在由内皮细胞中的 PECAM1 点定义的斜切血管内

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在 COVID #7 中，N puncta出现在部分分离的 SSTR2A-IR 软脑膜中，但不在 OB 实质中

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在 COVID #27（诊断后 93 小时死亡）中，密集的 M puncta出现在覆盖 OB 的软脑膜和含有 PECAM1 点的血管范围外，但不在 OB 实质中

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在 COVID #60（诊断后 40 小时死亡的患有活动性肿瘤疾病的患者）中，靠近 OB 的软脑膜样本，包括到硬脑膜的过渡区，含有丰富的 N 和 S puncta散布在 SSTR2A-IR 信号中

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In summary, SARS-CoV-2 does not appear to be a neurotropic virus, in the sense that it does not infect OSNs and OB neurons.

DISCUSSION

从 SARS-CoV-2 急性攻击人类嗅觉系统的角度来看，我们在这里对 COVID-19 采取了病毒中心论的观点。 我们将支持细胞鉴定为 OM 中的主要靶细胞类型，未能找到 OSN 和 OB 实质感染的证据，并在 OB 周围的软脑膜层中发现了病毒 RNA。

Catching SARS-CoV-2 in the act of attacking the nasal mucosa

Our cohort consisted of patients who died from or with COVID-19 in two major hospitals over a period of 12 months spanning the first three waves of the pandemic in Belgium. We consistently kept the PMI at approximately one hour. None of the 85 cases had to be excluded because of poor staining quality. As the onset of symptoms is not always clear or even known and is subject to patient recall, we chose to report the period until death starting from the time the NP swab was taken that led to the diagnosis.

30 个提供信息的病例在诊断后的中位时间为 8.8 天（Q1-Q3：4-12），而 38 个非信息案例的死亡时间为 21.1 天（Q1-Q3：11-37）（Mann-Whitney U 检验， U=144，z=-5.26，p<0.001）。 两名康复期的 COVID-19 患者在康复几个月后死亡，在组织样本中没有检测到病毒 RNA 或核衣壳-IR。 其中之一，COVID #3，是成功进行双侧肺移植的捐赠者。 我们在 COVID #3 的死后肺活检中检测到 N 和 S 点，但在 RM、OM 和 OB 中未检测到。

在 30 个提供信息的案例中，9 个（30%）在死亡时显示出持续的病毒复制，根据感觉点的存在来判断：COVID #7、#8、#27、#39、#51、#60、# 63、#67 和 #68。 这些患者在诊断后 8.5 天内死亡。 我们的七个 RNAscope 探针和核衣壳抗体组合代表了评估病毒复制的严格标准。 由于支持细胞具有吞噬活性，因此支持细胞中核衣壳-IR（或尖峰-IR 信号）的单纯证明不足以将这些细胞称为感染：该信号可能反映了来自感染细胞的碎片的吞噬作用。

Infection of sustentacular cells

RM 中的主要目标细胞类型是纤毛细胞。 我们对 RM 样本进行广泛检查的目的是为检查嗅裂粘膜样本提供合适的背景，鉴于 OM 作为 RMocean中的archipelago of islands的分散分布。 感染的不均匀性叠加在 OM 的分散分布上。 在 OM island中具有病毒 RNA 和核衣壳-IR 信号且明显包含 OSN 的六个 COVID-19 病例中，我们还在 RM 样本中检测到病毒 RNA 和核衣壳-IR 信号。

OM 中的主要靶细胞类型是sustentacular cells。这些非神经元细胞具有类似神经胶质的特性，并且在整个生命周期中都可以从 OE 中的干细胞再生。由于关于人类支持细胞的文献稀缺，目前尚不清楚实验室啮齿动物支持细胞的特性在多大程度上与人类相似。啮齿动物的支持细胞被赋予了无数的角色，统称为“支持”：吸收、解毒、代谢、滋养、吞噬、物理、分泌、结构。一种大鼠模型提出，支持细胞从 LP 的血管中吸收葡萄糖，并将其分泌到顶端的粘液中，为 OSN 纤毛提供燃料。对大鼠的细胞结构研究表明，单个支持细胞的顶半部内包裹着多个 OSN 树突。在人类中，带状连接复合体连接相邻的支持细胞和 OSN。鉴于这些密切关联，当支持细胞被 SARS-CoV-2 感染时，如果 OSN 在结构和/或生理上受到影响也就不足为奇了

从 ACE2 和 TMPRSS2 的表达可以推断，支持细胞可能对 SARS-CoV-2 感染敏感。 我们的发现与这些推论一致。 另一方面，人类冠状病毒 SARS-CoV 和 HCoV-NL63 也将 ACE2 作为进入受体，但不会引起嗅觉障碍，但 SARSCoV 除外。 有趣的是，尽管器官趋向性非常不同，但所有冠状病毒小鼠肝炎病毒株都使用相同的细胞进入受体。 受体的表达模式可以预测哪些细胞可以被感染，但并不意味着所有表达该受体的细胞甚至表达水平最高的细胞都是主要目标。 ACE2 的一种分泌形式可以解释其中的一些差异。 嗅觉上皮细胞中的 Neuropilin-1 表达已被用作促进 SARS-CoV-2 细胞进入和感染的辅助因子

Absence of evidence for infection of OSNs

同样，人类 OSN 不表达 ACE2 和 TMPRSS2 的流行解释是，OSN 可能不易受 SARS-CoV-2 感染。 尽管如此，在活着的和已故的 COVID-19 患者中已经提出了散发性 OSN 的感染。 但是受感染的 OSN 的比例极低，因此这些零星事件会导致嗅觉丧失是难以置信的。 不幸的是，在两项尸检研究中使用的唯一 SARS-CoV-2-S 抗体 3A2 可能会结合特定的非 SARS-CoV-2 抗原。 SARS-CoV-2 在 COVID-19 患者的 OSN 中的复制尚未得到证实。

我们将空间全转录组分析应用于 COVID #8 的 OE，以定量解决对 OR 基因表达的间接影响的假设。这种方法与 RNAscope 分析是互补和正交的。我们采用了患者内、载玻片内分析的分析方法，并在 OE 内询问了多个 AOI。我们对 GeoMx WTA 数据的解释是，在高病毒载量与低病毒载量的 AOI 中，来自受感染细胞亚群的 RNA 的相对贡献降低。 SARS-CoV-2 的非结构蛋白 nsp1 引起宿主 mRNA 的快速衰变，这与我们的观察结果一致，即受感染的支持细胞对于标记基因（如 UGT2A1、GPX3 和 SOX2）的斑点很少或没有斑点。 AOI 可以被视为数百个细胞的微小、定向活检，并且来自 AOI 的 RNA 表达计数被标准化。因此，OSN 标记基因标准化表达计数的反相关增加并不反映 OSN 中基因表达的上调，而是受感染的支持细胞中的 mRNA 衰减。 OR 基因的基因表达不会发生变化——既不下降也不上升。为了证实和扩展这些发现，有必要调查在诊断后死亡但仍然感染 OE 的病例。

Admittedly, the absence of evidence for infection of OSNs does not constitute evidence of absence. We leave the possibility open that OSNs may become infected and support viral replication in a subset of patients, or in certain disease courses or phases.

Leptomeningeal viral RNA presence does not necessarily equal neuroinvasion

OSN 似乎没有为 SARS-CoV-2 提供从鼻腔通过 OB 直接到达大脑的途径。一个有趣的观察结果是，我们在 30 个信息丰富的病例中的 11 个病例中，在 OB 周围的软脑膜层中发现了 SARS-CoV-2 斑点。我们推测这些斑点反映了游离细胞外病毒粒子内的 RNA，而不是受感染细胞在出芽前合成的细胞内病毒 RNA。感觉斑点的缺失反对在这些位点进行病毒复制。这些病毒粒子可能通过脑脊液到达软脑膜，脑脊液在蛛网膜下腔内流动。毕竟，它们可能是通过嗅觉神经到达颅腔的，但与其说是通过 OSN 轴突在细胞内迁移，不如说是在细胞旁搭便车。或者，软脑膜病毒粒子可能采取血行途径并继发于病毒血症，病毒粒子从脑膜血管溢出到脑脊液中。一种具有较少病理意义的解释是，病毒点仅仅反映了 RNA 血症，即血液中漂浮的病毒 RNA 序列，无论是整个基因组还是其片段。这些病毒粒子可能主要留在细胞外，不会引起炎症，这与关于 COVID-19 患者脑膜炎的临床报告稀少一致。但它们可能会导致一部分患者出现神经系统后遗症，例如通过促使产生针对神经抗原的自身抗体。人们很容易推测，这种病毒 RNA 的存在可能会扰乱信号从 OB 到大脑皮层的嗅觉传播，从而导致嗅觉功能障碍。

Here too, the absence of evidence for invasion of the OB parenchyma does not equal evidence of absence of invasion. In any case, our data do not support the neurotropic properties and neuroinvasive capacity that have been attributed by some to SARS-CoV-2

A look ahead

COVID-19 嗅觉功能障碍的发病机制可能在患者中是多因素和异质的。 不需要单一的机制来解释所有的嗅觉功能障碍病例。 我们支持一种病理生物学机制，即当受感染的支持细胞不再为 OSN 提供足够的结构和/或生理支持时，最终使嗅觉减弱或改变的事件序列开始。 它们甚至可能损害 OSN，例如通过作为抗病毒反应一部分分泌的趋化因子的旁分泌作用。 OE 是一个功能单元，由神经元成分 (OSN) 和非神经元成分（支持细胞）组成，这两种成分在整个生命过程中都由干细胞（基底细胞）再生。 嗅觉功能障碍通常是短暂的，当新产生的一组支持细胞恢复对 OSN 的支持时，嗅觉就会恢复

23andMe COVID-19 计划报告了一项全基因组关联研究，比较了近 70,000 名 SARS-CoV-2 检测呈阳性的先证者的嗅觉或味觉丧失与嗅觉或味觉丧失的情况。确定了一个相关的基因座，包括编码 UDP 葡萄糖醛酸转移酶的 UGT2A1 和 UGT2A2 基因。在大鼠中，UGT2A1 参与气味代谢，这有助于终止嗅觉信号。我们对 UGT2A1 斑点的发现支持支持细胞在 COVID-19 相关嗅觉功能障碍中的作用。鉴于支持细胞的表面位置，将 ACE2 受体呈递给粘液内的病毒粒子，粘膜免疫系统可能无法防止这些细胞的感染。它可能不得不容忍在重新感染期间恢复期 COVID-19 患者或在突破性感染期间完全接种疫苗的个体的支持细胞中病毒复制的短暂阶段。因此，在随后接触 SARS-CoV-2 时，先前的自然感染或疫苗接种可能无法完全防止嗅觉功能障碍。

Conclusion

Understanding the mechanisms whereby human sustentacular cells normally support OSNs in countless ways may yield clues for therapeutic interventions aimed at preventing, alleviating, or curing olfactory dysfunction in COVID-19. The spotlight ought to be shone on the unsung heroes of the sense of smell – the humble sustentacular cells.

Method,关注一下DSP

RNAscope in situ hybridization

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Immunohistochemistry

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Spatial whole-transcriptome profiling

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生活很好，有你更好