核酸等温扩增技术（Isothermal Amplification Technology）是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。

优点：与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。在一些领域具有明显的技术优势。该项技术的广泛应用将会对临床病原体的检验诊断、进出口检验检疫、疾病的预防和控制以及传染病病毒筛查等领域产生突破性进展，是一项很有市场前景的技术。

• 特异性高
• 分析速度快
• 成本低
• 突变率低
• 不需要升温降温过程，一台加热器即可操作
• 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小
• 方便诊断

核酸等温扩增的种类： 详细介绍前六种

• 环介导核酸等温扩增技术（LAMP）*
• 核酸依赖性扩增检测技术（NASBA）*
• 滚环扩增技术（RCA）*
• 实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）*
• 等温多自配引发扩增（IMSA）*
• 重组酶聚合酶扩增（RPA）*
• 单引物等温扩增（SPIA）
• 依赖解旋酶的等温扩增技术（HAD）
• 链替代扩增（SDA）
• 交叉引物扩增技术（CPA）
• Qβ复制酶反应

1. LAMP技术：

克服了传统PCR反应需要反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏性和扩增效率。

• 扩增反应在等温条件（60~65℃）下连续进行-> 可以使用简便、廉价的扩增装置
• 扩增效率高、可在短时间内完成扩增 -> 可在短时间内得出结果
• 有非常高的特异性 -> 6个区域设计的4种特异性引物，可得出“扩增反应发生=有目的菌存在”的结论
• 产生大量扩增产物，检测方法简便 -> 无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视方法确认扩增结果
• 从扩增到检测可以在1个反应试管内（封闭系统）完成 -> 可防止由于扩增产物产生的污染

存在的缺陷：
（1）所识别的靶标序列长度不得过大，一般在300bp以内。因此，无法进行长片段DNA的扩增；
（2）LAMP技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区，否则极易受到污染而产生假阳性结果；
（3）LAMP的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
（4）产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克隆等基因工程操作。

2. NASBA技术

NASBA技术是种RNA扩增法，因此其主要应用是对RNA病毒的检测。
整个反应能在42℃条件下进行，经过两个小时的扩增可将模板RNA放大到10⁹ ~10¹⁰倍。
灵敏度高、特异性强、保真度高

原理：
标准的NASBA反应体系中含有T7 RNA聚合酶、RNAse H、禽骨髓白血病病毒（AMV）逆转录酶（具备RNA和DNA依赖的DNA polymerase活性）、核糖核苷三磷酸（NTP）、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、一对特殊的引物和缓冲液。引物P1和长约45个碱基，其3‘末端大约20个碱基对与模板的3’末端互补，5‘末端含有能被T7 RNA聚合酶识别的启动子序列；引物P2大约20个碱基长，其序列与模板的5’末端一致。如图1所示，NASBA整个反应分为两相：非循环相和循环相。
在非循环相，引物P1与模板RNA退火， AMV逆转录酶催化合成一条cDNA链，形成RNA-DNA杂合分子，RNaseH 水解杂合分子上的RNA，留下一条单链DNA。引物P2随后与这条DNA链的5‘末端退火，AMV逆转录酶催化合成第二条DNA链。T7RNA聚合酶识别双链DNA中的启动子区，催化DNA转录为RNA，由每一分子模板可产生100拷贝的RNA。新合成的RNA进入循环相，成为反转录的模板。它们首先与引物P2结合，由AMV逆转录酶催化合成一条DNA链，形成RNA-DNA杂合分子，RNaseH水解RNA，留下一条单链DNA，引物P1退火，逆转录酶再催化合成一条新的含有T7 RNA聚合酶启动子的DNA片段，T7 RNA聚合酶再以此DNA为模板转录成更多拷贝的RNA，如此循环反复，RNA拷贝数被不断放大。

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缺点：反应成分复杂、需要三种酶导致成本偏高，需要反复加入逆转录酶和T7 RNA聚合酶。

3. 滚环放大技术

滚环放大（rolling circle amplification,RCA）技术是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方式而建立的一种核酸扩增技术。是基于滚环只有在单链闭合状态并有相应引物存在下才能同温滚动复制的原理。
基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温核酸扩增方法。在恒温的条件下，可以产生大量的与环形探针互补的重复序列。

类型：RCA包括线性扩增与指数扩增两种形式。

线性扩增RCA是指一条引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线性DNA单链。DNA的延伸可不断进行，产生的DNA链长可为亲代DNA单位长度的许多倍。利用RCA检测靶序列一般有两种途径：一种直接扩增环形单链模板；另一种首先通过连接反应环化与模板链杂交的探针，该项技术的广泛应用将会对临床病原体的检验诊断、进出口检验检疫、疾病的预防和控制以及传染病病毒筛查等领域产生突破性进展，是一项很有市场前景的技术。再扩增已环化的探针，然后检测扩增信号，这种探针常称为锁式探针（Padlock probe，如下图所示）。锁式探针的两端与靶核酸序列特异性互补，当有错配存在时，探针的连接反应就无法完成，接下来的RCA反应也就无法进行，因此确保了DNA和RNA检测中的高特异性。同时，锁式探针和靶序列的杂交会产生较稳定的拓扑结构，确保了杂交连接产物的稳定性。线性RCA的产区序列在长度上连续分布，其凝胶电泳图呈一条宽弥散带。线性RCA用于靶核苷酸扩增，仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，而且限制在小于200bp长度的环。由于其单链扩增特性，扩增产物一段可始终链接在固相支持物的引物上，非常适宜于固相形式的微阵列局部特异信号的检测。
指数RCA技术的原理与线性RCA相同，在线性RCA的基础上，再增加一条与环状DNA序列完全一致的引物，该引物和第一次线性RCA产物的部分序列互补并酶促延伸，同时置换掉下游杂交到扩增产物上其他拷贝段的引物，之后被置换掉的延伸产物又可以作为第一条引物的模板进行扩增，这样一来，扩增产物量在很短的时间内呈指数递增。文献通常称其为超分支滚环扩增（hyper-branched rolling circle amplification,HRCA）或者分支扩增（Ramification Amplification）。

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优点：：（1）高灵敏度。RCA具有极强扩增能力，线性RCA的扩增效率可达10⁵倍，而HRCA的扩增效率可达到10⁹倍。这一高灵敏度特性使其能够检测到单个拷贝子。扩增产物可以利用化学发光法、荧光法及纳米金等进行检测，成本低廉；（2）高特异性。利用锁式探针检测靶序列时，需要探针5’端与3‘端的两段识别序列与靶序列完全互补，因此可以区分单一位点的不同模式，该方法非常适合SNP的检测；（3）高通量。传统的核酸扩增技术如PCR等由于扩增产物扩散进液相而不能积累扩增信号，因此都不能在芯片上扩增，而RCA可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA产生的信号集中在这一点，从而实现原位扩增和载片扩增。另外RCA技术还能保持立体分析的多元性，即使同时分析检测许多目标根子也不会相互干扰；（4）操作方便。一方面，RCA是一种恒温扩增，不需要特别的热循环仪器；另一方面，可以直接扩增特定的DNA或者RNA分子，实现信号放大，避免了检测RNA链时预先进行的逆转录过程。

缺点：（1）锁式探针的成本问题。实验中所涉及到的锁式探针的长度一般在80个碱基左右，合成的费用较高。（这个问题目前应该不算难题。）（2）背景信号问题。RCA过程中未成环的锁式探针和未与锁式探针结合的模板DNA或者RNA也可产生信号，可能降低检测的灵敏度。目前采用的固相RCA能够在一定程度上减少背景信号的产生，扩大监测范围；在液相RCA反应中加入DMSO和T4基因结合蛋白，可以提高扩增效率。此外使用Exonucleas I和Exonuclease III混合的酶反应液，能够在连续反应后有效地去除线性锁式探针和未结合的模板DNA。（3）RCA 的结果目前没有理想的质控指标，因此，要想发展成为普通的实验室诊断技术，还应在探针设计和实验室质控等方面做进一步的探索。

4. SAT技术

个人感觉和NASBA是同一个技术，仅使用的逆转录酶不一致

实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing,简称SAT）是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。该技术具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。

原理：：带有T7启动子的引物和靶标RNA结合，开始首先通过M-MLV酶反转录酶合成cDNA；在M-MLV酶的RNaseH活性作用下靶标RNA降解，形成单链cDNA；之后反向引物与cDNA结合，在M-MLV RT酶的聚合酶活性作用下产生靶标核酸（RNA）的一个双链DAN拷贝，且该双链带有T7启动子。在T7RNA多聚酶的作用下，一条DNA双链上产生多个（100~1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况，整个扩增过程都在同一温度（42℃）下进行。

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优点：（1）恒温扩增：不需要繁琐的升降温步骤，一方面可以降低对仪器的要求，降低试验成本；另一方面也能够使SAT反应体系不受样品中DNA、肝素、血红蛋白、EDTA、脂质等污染因子的影响。提高检测稳定性和结果准确性；同时由于没有高温步骤，也可以在一定程度上降低污染。
高特异性：针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特异性的扩增和检测，有效防止假阴性结果。
（2）SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境中易降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的依据，因此更利于用药之后疗效的监测和判愈。
（3）SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以更大程度地确保检测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假阳性、假阴性结果。

5. IMSA扩增

等温多自配引发扩增即（isothermal multiple self-matching-initiated amplification）是一种新型的等温核酸扩增技术。

ISMA最大特点就是，在等温核酸扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构。这种结构的大量产生富集，使得随后循环扩增引发几率明显增加，继而是的扩增效率提高，最终使得检测灵敏度提升。理论上，IMSA的灵敏度应该要高于LAMP的灵敏度。结果判定上，可同LAMP技术一样，能够通过观察副产物焦磷酸镁白色沉淀、于扩增前或后加入显色剂观察颜色变化。
理论有点复杂，暂时没看懂。但感觉自发配引发扩增和LAMP类似。

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IMSA产物检测：
（1）琼脂糖凝胶电泳法
（2）观察沉淀法
（3）颜色判定法
（4）实时浊度法
（5）实时荧光法

优点： （1）IMSA不仅拥有LAMP检测技术类似的应用优点，在引物设计和扩增原理上还具有其独有的特点，使得其具备比LAMP更高检测灵敏度的潜力。
（2）该技术一定程度上能打破日本LAMP专利在我国的应用限制，使其更好地服务于我国的传染病防控、食品安全检测和环境物种保护等各个领域。

6. RPA技术

RPA技术（recombinase Polymerase Amplification)，2006年由剑桥大学的OlafPiepenburg等人建立。通过重组酶聚合酶进行扩增反应，具有快速、等温、常温扩增的特点，是一种完全不同于PCR的扩增技术。RPA技术通过重组酶配对DNA模板的核酸引物，聚合酶合成新核酸链，可以在极短的时间内（15分钟左右）完成指数级扩增。RPA的扩增产物可以通过荧光实时检测，也可以通过电泳、侧向流动免疫测定法（Lateral Flow Strips）等终点检测方法检测。

该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段结合，启动DNA复制，不需要DNA解链过程。

RPA技术主要依赖三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最适宜反应温度在37℃左右。
原理：首先是重组酶与引物结合，形成蛋白-DNA复核物。接着在dsDNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。而被替换的DNA链与SSB（单链DNA结合蛋白）结合，防止进一步被替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成时间。整个过程进行地非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

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特点：（1）速度。 RPA非常快速。在37℃_{42℃这一通常最适宜的反应温度下，只需少量核酸分子即可在3}10分钟内扩增至可检出水平，这将取决于靶标大小。在大多数情况下，只需要一个人即可在半小时内采集样本、制备样本、运行检测并取得结果，无需专业培训。
（2）灵敏度。RPA可检测复合样本中的单拷贝DNA和10 拷贝甚至更少RNA，而无需预先纯化核酸。
（3）特异性。RPA具有高度特异性。该技术可从可能含有数百纳克来自不同物种的不相关复合基因组DNA（包括人DNA）的样本中识别并扩增单个DNA分子，抗干扰能力强。
（4）恒温运行。RPA在恒定的低温（37℃~42℃最适宜）下运行，对于某些应用，如果需要，即使体温也可支持RPA扩增。该反应在偏离温度及低温设置下也表现稳健，即使在常规室温25℃下也能奏效，虽然反应速度会下降；在此温度下，只要生物化学过程被正确配置，仍可在一小时内获得结果。
（5）样本容差。RPA对样本类型的要求宽松。有时可直接检测未经核酸纯化的原始样本，例如血液、鼻拭子或培养基。通常，只需采用基本的病原体裂解方法处理样本以释放核酸即可。例如热处理或弱碱处理。每种检测所需的最合适的样本制备方法取决于病原体滴度、是否存在抑制剂以及裂解要求等因素，并将需要设计到检测程序中。RPA对某些复合样本类型的宽容度使该技术非常适合广泛的现场实地应用。
（6）广泛的适用性。RPA能够方便地应用于任何DNA或RNA靶标，无序列偏好性，这一点对于NGS尤其重要。如果将逆转录酶添加到反应混合液中开发出超灵敏的RNA一步检测法。
（7）多重检测。通过将多种引物同时添加到同一反应管内，单次RPA测试即可扩增和检测多种不同的靶标。
（8）低成本设备。RPA仅需要基本的检测设备，可以使用PRA技术开发出适合各种应用和环境的人性化诊断方法和试剂盒。
（9）灵活的试剂形态。核心反应组分能够以稳定的干燥形态供货，该形态易于运输，且无需冷藏即可存储12个月（稳定性可能因用途不同而有变化，因此仍建议在冷藏条件下长期存储），也能够以PCR试剂更常见的液体形态供货，该形态允许针对特定的应用改变反应体积和组分比例。
（10）多种检测形式。RPA可应用于各种检测系统和仪器，包括实时荧光探针和夹心法等形式。

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RPA引物设计：RPA的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过段会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增产物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，需要摸索条件优化。

应用：（1）RPA技术成为致病菌检测的得力工具。目前已建立的目标病原菌检测有艰难梭状芽孢杆菌、结核杆菌、MRSA、淋病奈瑟氏菌、沙门氏菌、大肠埃希菌STEC、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、疟原虫（P. falciparum）、冠状病毒（中东呼吸综合症冠状病毒MERS-CoV）、HIV等。另外在病原体Panel检测也大显身手。检测传染性疾病的综合panel，有助于资源匮乏地区进行实地分子诊断酶，对生物防 护工作也有很大帮助。《Journal of Clinical Microbiology》杂志2013年发表的一篇文献描述了开发的一个RPA检测panel，对土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）、鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、VARV病毒进行RPA分析，对裂谷热病毒（Rift Valley fever virus）、埃博拉病毒、Sudan病毒和马尔堡病毒进行RT-RPA分析。研究显示，这些RPA和RT-RPA的分析灵敏度大多在16-21个分子之间（与实时PCR相当）。42℃下只需运行6-10分钟，而且不存在交叉反应（Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.J Clin Microbiol. 2013 Apr;51(4):1110-7. ）。（2）另外RPA在癌症研究中也有应用。新加坡研究团队在Lab on a chip 上发表了一种能够快速检测癌症单点突变的新技术，等温固相扩增/检测（ISAD）。这是一种无需标记的实时检测技术，将基于硅基微环（silicon microring）的固相扩增与等温重组酶聚合酶扩增（PRA）结合在一起。Talanta杂志上也发表了一项用到RPA技术的癌症研究。该研究在超灵敏生物条码分析（BBC）、适配体（aptamer）和RPA的基础上，开发了一个检测细胞色素C(Cyto-c)的新生物条码分析法（ABC）。细胞色素C是细胞死亡的重要标志物。

RPA关注的问题：

Q1：RPA反应能实现多重化么？
可以。RPA在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量(nmol)zui好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。
Q2：RPA反应能对模板进行定量么?
可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。
此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。
Q3：扩增反应能进行荧光终点分析么？
可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。
Q4：RPA支持生物素或荧光标记的寡核苷酸么？
支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。
Q5：能用插入性染料实时监控RPA么？
可以。插入性染料可以在RPA反应中进行定量和监控。不过，这种染料可以结合任何双链DNA，会生成来自引物的假阳性信号。由于RPA扩增在常温下进行，这种噪音会比PCR严重一些。
Q6：跑胶之前需要回收RPA产物么？
需要。RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳，如果不进行产物回收，跑出来的带会出现拖尾。

参考文献

1. 核酸等温扩增-杨银辉
2. 核酸检测革命：可替代PCR的犀利技术——RPA