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好了，这一篇继续分享单细胞空间的联合分析，看一下在脑转移CD8⁺ T细胞的时空图谱，参考文献在The CD8⁺ T cell landscape of human brain metastases，看来单细胞空间的联合分析运用，慢慢就会成为主流。

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Abstract

尽管检查点阻断免疫疗法改善了结果，但脑转移患者在转移性癌症患者中预后最差。免疫检查点阻断剂靶向耗尽的 CD8⁺ T 细胞上的抑制性受体，如 PD-1，以恢复其抗癌功能。然而，许多患者在对免疫检查点封锁的初始反应后没有反应或进展，尽管脑转移的局部治疗有很好的选择，但远处颅内衰竭很常见。为了开发更有效的脑转移治疗策略，了解脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞的表型是必不可少的。在这里，对脑转移瘤中包含的 CD8⁺ T 细胞进行了详细的表征。脑转移灶被 CD8⁺ T 细胞密集浸润；肿瘤样本的血液污染很少见。与患者匹配的循环细胞相比，脑转移浸润的 CD8⁺ T 细胞具有独特的表型，其特征是 PD-1 的表达更频繁，亚群由额外的共抑制分子和驻留标记 CD69 的表达定义。单细胞 RNA 测序鉴定了脑转移浸润 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞内的四种表型亚群。其中两个populations——一个终末分化populations和一个分裂populations——的特征是共抑制分子的高表达和缺乏祖细胞标志物（如 TCF-1）的表达。终末分化和分裂populations之间存在显着的 T 细胞受体 (TCR) 重叠，表明分裂细胞产生终末分化细胞。这两个populations与其他脑转移浸润性 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞之间的 TCR 重叠最小。来自脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞的 T 细胞克隆在循环中很少见，特别是来自终末分化和分裂populations的克隆。分析系统地鉴定了对微生物抗原特异的bystander CD8⁺ T 细胞；这些细胞浸润脑转移灶并表达与衰竭的祖 CD8⁺ T 细胞共享的基因，如 TCF7 和 IL7R。对脑转移瘤进行了空间转录组学，并使用一种新方法从空间转录组学数据中获取 TCR 序列。这些数据揭示了 TME 内由其基因表达模式和细胞因子谱定义的不同生态位。终末分化的 CD8⁺ T 细胞优先占据肿瘤实质内的niche。总之，结果表明，抗原特异性限制了脑转移 TME 内 CD8⁺ T 细胞可用的空间定位、表型状态和分化途径。

Introduction

脑转移会影响大约 20% 的癌症患者，与颅外转移相比，脑转移的总生存期明显更差。尽管它们对免疫检查点阻断 (ICB) 有反应，但脑转移瘤也接受局部治疗 - 放射治疗有或没有手术切除 - 因此很难辨别 ICB 后 CD8⁺ T 细胞重振对这些肿瘤的孤立影响。大脑包含一个独特的免疫环境，通常被认为具有免疫抑制作用，可保护中枢神经系统 (CNS) 免受过度炎症的影响。Although there is loss of blood-brain-barrier (BBB) integrity within brain tumors, the consequent less-selective blood-tumor-barrier (BTB) and surrounding stroma of brain tissue may together affect inflammatory signaling and cell recruitment to the tumor microenvironment (TME) of brain metastases.脑转移瘤被 CD8⁺ T 细胞浸润，这可能与 CD8⁺ T 细胞浸润患者匹配的原发肿瘤无克隆相关，这表明与原发肿瘤相比，脑转移可能具有不同的决定因素来控制对 ICB 的反应。

CD8⁺ T 细胞是细胞毒性淋巴细胞，通过其 T 细胞受体 (TCR) 与 MHC I 类肽复合物的抗原特异性结合来识别感染或肿瘤细胞。抗原清除后，效应 CD8⁺ T 细胞分化为记忆细胞，防止抗原再次暴露。在抗原未被清除的情况下，如癌症或慢性感染，效应 CD8⁺ T 细胞会耗尽，一种以增殖和细胞毒性能力受损为特征的状态。耗竭的 CD8⁺ T 细胞表达抑制性分子，如 PD-1，进一步促进耗竭表型。 PD-1 和其他抑制通路是 ICB 药物的目标，ICB 药物会阻断衰竭的 CD8⁺ T 细胞中的抑制性信号传导，以挽救其增殖和细胞毒性功能。 ICB 药物在癌症治疗中的临床应用已导致疾病控制和患者存活率的显着改善，但是很大比例的癌症患者患有难治性疾病，对 ICB 没有反应或在初始反应后进展。提高 ICB 功效的一种策略是同时阻断在耗竭的 CD8⁺ T 细胞上表达的多种抑制性分子。为了确定这种组合方法的潜在治疗靶点，需要对靶点耗尽的 CD8⁺ T 细胞进行详细的表型表征。

耗尽的 CD8⁺ T 细胞由具有不同功能、抑制性分子表达和组织归巢模式的不同表型亚群组成。austed progenitor PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞由转录因子 TCF-1 的表达维持，具有自我更新和产生进一步分化的子细胞的能力。Transitory PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞是这些祖细胞的直接后代，其特征是效应分子的表达和 TCF-1 的缺失。这些transitory cells 是迁移的；在这种状态下发现了癌症和慢性感染中的循环抗原特异性 CD8⁺ T 细胞，以 CX3CR1 表达为标志。在迁移到非淋巴组织后，这些transitory cells 进一步分化为终末分化的populations，抑制分子的表达增加。这些most-exhausted CD8⁺ T 细胞驻留在非淋巴组织中，效应器功能较差，并且缺乏增殖能力。

这些 CD8⁺ T 细胞群对 PD-1 通路阻断的反应各不相同。 ICB 后观察到的增殖爆发需要耗尽的祖细胞群，这会导致暂时效应细胞的数量显着增加。 ICB 还作用于抗原部位的效应 CD8⁺ T 细胞，通过增加颗粒酶和穿孔素等分子的表达来改善其效应功能。 鉴于其需要响应 PD-1 通路阻断的增殖爆发，耗尽的 CD8⁺ T 细胞的祖细胞群在肿瘤免疫学研究中受到了极大的关注，其中许多已经量化了肿瘤浸润的 TCF-1⁺ 细胞。 然而，肿瘤浸润性 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞的抗原特异性很少被确定。

在人乳头瘤病毒阳性 (HPV+) 头颈部鳞状细胞癌中发现了肿瘤特异性耗尽祖 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞，该细胞生长在口咽淋巴组织中。最近还在黑色素瘤和非小细胞肺癌中发现了类似的祖细胞，其中大多数肿瘤特异性 CD8⁺ T 处于终末分化状态。在小鼠模型中，抗原特异性耗尽祖 CD8⁺ T 细胞在肿瘤引流淋巴结中富集，并且在慢性感染期间仅在次级淋巴器官中发现。然而，尚不清楚肿瘤特异性耗尽的祖 CD8⁺ T 细胞是否存在于大脑中生长的肿瘤中。在缺乏抗原特异性信息的情况下，通常从表型推断 CD8⁺ T 细胞功能。然而，这种方法被一些分子标记在 CD8⁺ T 细胞分化的多个阶段的表达所混淆。例如，TCF-1 由幼稚、记忆和衰竭的祖 CD8⁺ T 细胞表达。 CMV 和 EBV 特异性效应记忆 CD8⁺ T 细胞共表达 TCF-1 和 TOX，一种与 T 细胞耗竭相关的转录因子，并且在原发性和转移性脑肿瘤中发现了 EBV 和流感特异性 CD8⁺ T 细胞。此外，据报道，大脑驻留记忆细胞可维持抗原非依赖性 PD-1 表达。

在这里，对 31 名接受手术切除大的和/或有症状的脑转移瘤的患者的脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞及其周围 TME 进行了详细的表征。脑转移灶被 CD8⁺ T 细胞充分浸润，其中大部分是 PD-1⁺。使用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，在浸润脑转移的 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞中鉴定了四个clusters：分裂细胞、终末分化细胞和两个与衰竭的祖细胞共享一些表型特征的细胞群。这前两个cluster彼此共享显着的克隆重叠，但与祖细胞样种群具有最小的 T 细胞受体 (TCR) 重叠。我们系统地鉴定了脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞中微生物抗原特异性的bystander细胞；这些在终末分化和分裂的群体中很少见，并且具有类似于衰竭祖细胞的表型。bystander在脑转移浸润的 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞和循环 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞中以相似的频率存在。为了确定肿瘤内特定 CD8⁺ T 细胞克隆的位置，我们使用一种新方法从空间转录组学数据中获取 TCR 序列，并表明来自每个表型群体的 CD8⁺ T 细胞在空间上仅限于脑转移 TME 的特定区域，具有不同的基因表达模式和细胞因子谱。总之，我们的结果表明，脑转移被不同的 CD8⁺ T 细胞群体浸润，这些 CD8⁺ T 细胞采用特定的表型，并根据抗原特异性分离到 TME 内的不同niche中。这些数据可以指导治疗脑转移瘤的新型免疫治疗策略。

Results

Human brain metastases are well-infiltrated by CD8⁺ T cells

在超过 18 个月的时间里，我们从埃默里大学医院的 31 名接受了至少一个脑转移瘤手术切除的患者中收集了新鲜的脑转移肿瘤标本和匹配的血液样本。 样本是在手术切除时新鲜获得的，包括多种原发肿瘤类型的混合物，其中最丰富的是肺癌，这与它是最有可能转移到大脑的原发癌症一致。所有患者都未接受免疫治疗。 通过流式细胞术定量所有样品的免疫浸润。 一部分样本用于高参数流式细胞术、单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)、T 细胞受体 (TCR) 测序和具有空间分辨转录组学的免疫组织化学.

脑转移灶被免疫细胞浸润，范围从每克肿瘤 2.9 x 10⁴ 到 2 x 10⁷ 个 CD45⁺ 淋巴细胞不等（中位数为 7.6 x 10⁵），其中乳腺癌脑转移灶的浸润密度最低。 CD8⁺ T 细胞浸润也各不相同（范围为 3.4 x 10³ 至 1.5 x 10⁷，中值 2.0 x 10⁵ CD8⁺ T cells/gram of tumor），乳腺癌组织学再次显示浸润密度最低。 尽管样本之间存在显着差异，但无论原发肿瘤类型如何，CD8⁺ T 细胞在脑转移灶中的淋巴细胞比例相似。

A subset of brain metastasis-infiltrating CD8⁺ T cells have a progenitor phenotype

为了query脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞的表型，对患者匹配的肿瘤浸润和循环 CD8⁺ T 细胞进行了高参数流式细胞术。尽管存在一些差异，但表达 PD-1 的脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞的频率在不同的肿瘤组织学中是一致的。我们比较了其他共抑制分子、转录因子和效应分子颗粒酶 B (GZMB) 在 PD-1^- 和 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞上的表达。与 PD-1^- 细胞相比，TOX 和共抑制分子 TIM3、CD39 和 CTLA-4 在 PD-1⁺ 细胞上显着更高。尽管 CD69 在 PD-1⁺ 细胞上表达更高，但近一半的 PD-1^- 细胞也表达 CD69，表明这些细胞中的一部分也存在于肿瘤中。虽然效应分子 GZMB 和共刺激分子 CD28 在 PD-1⁺ 和 PD-1^- CD8⁺ T 细胞之间的表达相似，但 CD8⁺ T 细胞的祖细胞功能标志物（如 CD127 和 TCF-1）在 PD-1^- 细胞中更高。

关于脑转移瘤中 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞的丰度和表型知之甚少，并且不清楚肿瘤特异性耗尽的祖细胞是否存在于这些肿瘤中。 CD127 和 CD28 已被用作慢性感染和癌症中 TCF-1⁺ 祖 CD8⁺ T 细胞的细胞外标志物。在脑转移浸润的 CD8⁺ T 细胞中，与 PD-1⁺ TCF-1^- 细胞相比，CD28 和 CD127 在 PD-1⁺ TCF-1⁺ 上的表达频率更高，但它们的表达并未完全重现 TCF-1 的表达。 CD127 在 PD-1⁺ TCF-1^- 细胞中大部分不存在，但仅在一半的 PD-1⁺ TCF-1⁺ 细胞中表达。 CD28 是一种更敏感的 TCF-1 表达标记物，在超过 75% 的 TCF-1⁺ 细胞上发现，但缺乏特异性，在超过 50% 的 TCF-1^- 细胞上表达。转录因子 TOX 是 CD8⁺ T 细胞耗竭的标志物和调节剂，在癌症和慢性感染的抗原特异性 CD8⁺ T 细胞上表达。在我们的队列中，44% 的脑转移浸润 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞表达 TOX，37% 是 PD-1⁺； 14% 的 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞共表达 PD-1 和 TOX。因此，尽管脑转移灶中 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞的频率很高，但这些细胞表型多样，仅 TCF-1 表达可能不足以作为肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞祖细胞功能的标志物。

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Phenotypically distinct populations of CD8⁺ T cells infiltrate brain metastases

所有肿瘤浸润和匹配的循环 CD8⁺ T 细胞的 FlowSOM 聚类确定了六个populations。cluster 1 和cluster 2 优先在血液中发现，cluster 4 和cluster 5 仅是肿瘤浸润。cluster 3在血液和肿瘤中以高频率存在，cluster 6在血液和肿瘤中都是罕见的。cluster 1 由初始 CD8⁺ T 细胞组成，其特征是表达 CCR7 和 CD45RA；它在肿瘤中的低频率表明脑转移标本的血液污染最小。cluster 2 中的细胞主要是 CD45RA⁺ 并表达高水平的颗粒酶 B。cluster 3 存在于循环和肿瘤compartments中，由具有高水平 CD28、CD127 和 TCF-1 的异质 PD-1- 和 PD-1dim 细胞组成。cluster 4 和 5 中的细胞均表达 CD69，这与组织驻留及其在肿瘤中的优势一致。cluster 4 和 5 中的细胞也表达 CD38，TCF-1 和 CD127 的表达量较低；后两种标志物在肿瘤内 CD8⁺ T 细胞上的表达主要限于cluster 3，即肿瘤和循环compartments之间共享的cluster。cluster 5 似乎是一个耗尽的、终末分化的 CD8⁺ T 细胞群，表达 PD-1 以及其他共抑制分子，包括 CTLA-4、CD39 和 TIM-3。cluster 5 中的大多数细胞也表达 TOX，并且是 TCF-1^-。cluster 6 中的细胞正在分裂 (KI-67⁺) 并表达激活标记，例如 HLA-DR 和 CD38，以及耗竭标记，例如 PD-1。cluster 6 细胞表达 CD28，但 TCF-1 和 CD127 水平低。

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Brain metastasis-infiltrating CD8⁺ T cells comprise four metaclusters with distinct transcriptional phenotypes

对肿瘤相关病毒和新抗原表位特异的 CD8⁺ T 细胞表达 PD-1。在我们的队列中，肿瘤内的 PD-1 表达在终末分化的第 5 cluster和分裂细胞中最高。 PD-1 在富含肿瘤的cluster 4 和cluster 3 中的一些细胞中也以较低水平表达，这在血液和肿瘤之间共享。为了确定转录谱、询问分化途径并检查这些 PD-1 表达细胞的抗原特异性，在手术切除后立即对从三个非小细胞肺癌 (NSCLC) 脑转移瘤和两个黑色素瘤脑转移瘤中分离的分选 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞进行了 scRNA-seq 和 TCR 测序。选择这两种组织学是因为它们通常会转移到大脑。还从患者匹配的血液中分选了幼稚 CD8⁺ T 细胞作为对照。从 22,828 个已测序的细胞中，我们确定了 14 个 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞群，这些细胞群被分层聚类为 5 个具有相似基因表达模式的meta-cluster：A、B、C、Dividing (D) 和 Naïve。与我们的流式细胞术分析一致，原始细胞主要存在于血液中。五名患者中有四名在每个 AD cluster中都有细胞，除了患者 17，他在meta-cluster C 中没有细胞。肺癌脑转移与黑色素瘤的脑转移之间每个meta-cluster中的细胞百分比没有差异，这表明在我们的队列中，起源组织并没有强烈影响脑转移浸润的 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞的表型。

metaclusters A 和 D 中肿瘤浸润的 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞具有与 FlowSOM cluster 5 相似的终末分化表型，其特征是编码共抑制分子的基因高表达，如 CTLA4、ENTPD1（CD39）、HAVCR2 (TIM-3) 和 LAG3，与包含肿瘤反应细胞的这一populations一致。分裂metacluster中的细胞还通过细胞周期基因的高表达来定义，例如 MKI67 (KI-67) 和 TOP2A。基因集富集分析 (GSEA) 显示，在 CD8⁺ T 细胞耗竭的鼠 LCMV（淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒）模型中表征的瞬时转录特征在 Dividing metacluster 中富集，表明这些细胞可能正在经历从干细胞样到终末期的分化-分化的 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞。metacluster B 和 C 表达最低水平的共抑制标记。它们通过在metaclsuter C 中组织驻留基因（如 CD69）的更高表达而相互区分。metaclsuter B 和 C 与终末分化和分裂细胞相比包含具有更高表达祖标记 TCF7 (TCF-1) 和IL7R (CD127)。

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Terminally-differentiated CD8⁺ T cells have minimal clonal overlap with circulating or progenitor-like tumor-infiltrating CD8⁺ T cells

为了确定循环和脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞之间的克隆关系，我们对从患者匹配的外周血中分选的非初始 PD-1⁺ 和 PD-1^- CD8⁺ T 细胞进行了 TCR 测序。 与循环 PD-1^-CD8⁺ T 细胞相比，循环 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞的 TCR 多样性较低，与肿瘤浸润细胞的重叠更多。 然而，循环和肿瘤浸润 CD8⁺ T 细胞之间的总体重叠很小，这表明表达富含肿瘤的 TCR 的循环 CD8⁺ T 细胞很少见。 循环肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞似乎更加罕见，因为来自终末分化细胞的 TCR 在血液中很少被发现。 确实表达富含血液的 TCR 的肿瘤浸润细胞主要位于metaclsuters B 和 C。这与流式细胞术数据一致，其中肿瘤中的 TCF-1 和 CD127 表达仅限于 FlowSOM cluster 3，这个细胞群在血液和肿瘤之间共享。

为了探究脑转移浸润 PD-1⁺CD8⁺T 细胞的分化途径，分析了 scRNA-seq metacluster之间的 TCR 重叠。终末分化和分裂细胞（分别为metacluster A 和 D）彼此之间有大量的 TCR 重叠。然而，这些分裂和耗尽的细胞与metaclusters B 和 C 表现出最小的 TCR 重叠，其中包含具有较少耗尽表型的细胞。每个患者肿瘤内的大多数 CD8⁺ T 细胞克隆——尤其是最丰富的克隆——大多仅限于耗尽（metacluster A/D）或祖细胞样（metacluster B/C）表型，表明这些群体在很大程度上具有未共享的抗原-特异性。与metacluster B/C 中的细胞相比，终末分化细胞（metacluster A/D）中的 TCR 多样性也较低。基于这些数据，假设metacluster B 和 C 中的细胞可能主要是对非肿瘤抗原特异的记忆bystander CD8⁺ T 细胞，并且在从循环迁移后已驻留在肿瘤内。

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Brain metastasis-infiltrating bystander CD8⁺ T cells have phenotypic similarities to exhausted progenitor CD8⁺ T cells

以前的研究已经确定了肿瘤浸润的 bystander CD8⁺ T 细胞，但对脑转移的 bystander 浸润知之甚少。 我们查询了 VDJdb，这是一个具有已知特异性的 TCR 数据库，与来自我们的 scRNA-seq 数据的 TCR 匹配，并在两名患者中的每一个中确定了一个 CMV 特异性 TCR。 两种 CMV 特异性 TCR 均由metacluster B/C 中的细胞专门表达。 为了通过实验query脑转移浸润bystander CD8⁺ T 细胞的丰度和表型，我们体外扩增了四名患者的 PBMC，这些患者的 scRNA-seq 数据是可用的。 我们用微生物肽池 (CEFX) 刺激这些细胞，通过 FACS 分离 IFNγ+ 和 IFNγ-CD8⁺ T 细胞，并对每个子集进行 TCR 测序，以确定对 CEFX 刺激有细胞因子分泌反应的 TCR，因此是微生物特异性的。

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比较来自该测定的 TCR 序列与从上述 scRNA-seq 数据中鉴定的序列显示，CEFX 特异性细胞占脑转移浸润 PD-1⁺ CD8⁺T 细胞的 0.07% 至 1.70%。 从表型上看，在所有四名患者的 B/C metacluster中都发现了 CEFX 特异性脑转移浸润性 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞，这些细胞显著富集。 中位数为 1.9% 的metacluster B/C 细胞是 CEFX 特异性的，而metacluster A 和 D 为 0.07%，总循环 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞为 1.1%。 值得注意的是，来自患者 17 的 12.3% 的metacluster B/C 细胞是 CEFX 特异性的。 重要的是，这些经过实验验证的bystander细胞中的一些具有与其他研究中表征的肿瘤特异性祖细胞 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞相似的转录表型，以 IL7R（CD127）、TOX 和 TCF7（TCF-1 ）的表达为标志 。 在肿瘤内的 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞中，IL7R 和 TCF7 在 CEFX 特异性细胞上的表达最高。

鉴于通过这种方法测试的已知微生物 T 细胞表位数量很少，并且循环和肿瘤浸润 PD-1⁺ T 细胞之间的bystander 、非肿瘤特异性细胞的频率相似，人脑转移灶中总bystander 细胞的频率可能要高得多。 此外，考虑到与肿瘤浸润性终末分化细胞和循环细胞相比，metacluster B/C 中 CEFX 特异性细胞的富集，很可能metacluster B/C 中的许多细胞对非肿瘤抗原具有特异性并且不具有在肿瘤内产生具有终末分化表型的细胞。 虽然这些数据并不排除脑转移灶中存在小的肿瘤特异性耗尽祖细胞群，但大部分肿瘤浸润的 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞似乎是非肿瘤抗原特异性的bystander 细胞。

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CD8⁺ T cell phenotype is related to spatial distribution within the tumor

鉴于与肿瘤内的其他亚群相比，终末分化细胞的不同表型和抗原特异性，我们假设脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞的每个亚群可能位于 TME 的不同区域内，因此从周围组织接收不同的信号。 为了测试这一点，我们在六个脑转移组织切片上进行了空间转录组学，一种原位测量基因表达的方法：一个黑色素瘤、一个肾细胞癌、一个乳腺癌和三个肺癌。 基于基因表达对捕获点进行聚类，并且基于 H&E 染色中的外观对每个聚类进行注释。

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肿瘤实质——指的是肿瘤细胞区域——和周围的基质很容易通过它们的基因表达谱来区分。 对于肿瘤正常边界清晰可见的切片，肿瘤实质和周围基质之间差异表达的基因数量范围为 3,914-7,480。 在肿瘤实质和基质混合的两个样本中，两个区域之间差异表达的基因数量为637和2,327。 六个组织切片之一完全由肿瘤实质组成，排除了该分析。

TME 异质性和免疫浸润之间的相互作用很明显。在肾细胞癌病例中，肿瘤“small nests” ”的CD8A、CD8B和CD4表达密度高于肿瘤的“large nests” ”，血管周围结缔组织增生区域的转录水平甚至更高。此外，在肿瘤实质和脑组织可见的两个肺癌样本中，CD3E 转录水平在肿瘤与脑的界面处最高。在肿瘤实质被炎症包围的黑色素瘤脑转移组织切片的示例中（患者 16），CD3E、CD4、CD8A 和 CD8B 转录本的密度在肿瘤周围炎症和直接相邻的肿瘤实质中最高。总之，这些结果与之前的观察结果一致，即与肿瘤核心相比，免疫细胞在脑转移的外围区域富集。 在黑色素瘤样本中，与 CD8⁺ T 细胞的终末分化表型相关的基因表达，如 HAVCR2 (TIM-3)、LAG3、CXCL13 和 GZMB 在炎症附近的肿瘤实质中最高，而祖标志物 TCF7 (TCF-1) 和 IL7R (CD127) 在炎症基质中的表达最高，表明免疫细胞表型确定其在不同 TME 中的位置。在黑色素瘤样本中，与 CD8⁺ T 细胞终末分化表型相关的基因，如 HAVCR2 (TIM-3)、LAG3、CXCL13 和 GZMB，在炎症附近的肿瘤实质中表达最高。总之，这些数据表明 CD8⁺ T 细胞表型和脑转移 TME 内的位置是相关的。

Terminally-differentiated CD8⁺ T cell clones are preferentially located in the tumor parenchyma

定义这些 CD8⁺ T 细胞表型的基因也可能由 TME 内的其他细胞表达，例如 CD4⁺ T 细胞。 因为已经证明脑转移瘤中的 TCR 克隆受到表型限制——也就是说，表达单个 TCR 的细胞主要在 scRNA-seq metacluster A/D 或 B/C 内，但不是两者——TCR 在肿瘤内的定位将允许肿瘤内特定 CD8⁺ T 细胞表型的可视化。 为了确定脑转移 TME 中 CD8⁺ T 细胞是否存在空间限制，开发了一种从空间转录组学基因表达文库中扩增 TCR 转录本的方法。 通过将空间转录组学和 scRNA-seq 数据中发现的 TCR 克隆联系起来，我们可以确定具有特定转录表型的 CD8⁺ T 细胞在 TME 中的位置。

在对其进行空间转录组学的六个组织中，来自新鲜组织的 scRNA-seq 数据可用于两个 - 患者 15 和 16，分别是肺癌和黑色素瘤样本。 在黑色素瘤样本（患者 16）中，我们观察到具有 metacluster A/Dividing 表型的 CD8⁺ T 细胞克隆主要位于肿瘤实质中，而具有 metacluster B/C 表型的 CD8⁺ T 细胞克隆主要存在于肿瘤周围炎症中 . 不仅metacluster A/Dividing TCR 在肿瘤实质中富集，而且与具有metacluster B/C 表型的那些相比，在肿瘤外发现的具有这种表型的 TCR 克隆也优先位于更靠近肿瘤边界的位置。 这些发现在肺癌脑转移（患者 15）中得到证实，其中整个组织切片是肿瘤实质，仅由metacluster A/分裂细胞表达的 TCR 驻留。

鉴于 TME 内特定位置的特定 CD8⁺ T 细胞子集的这种偏好，我们试图确定它们是否根据它们的位置接收不同的信号输入。因此，比较了肿瘤不同空间基因表达cluster之间的转录谱。在肾细胞癌样本（患者 24）中，基因表达因肿瘤结构而异：305 个基因在肿瘤的小巢和大巢之间差异表达。与大肿瘤巢相比，小肿瘤巢内的 MHC I 表达更高，这表明同一肿瘤内的 CD8⁺ T 细胞可能会根据它们在实质内的位置接受不同水平的 TCR 刺激。在黑色素瘤样本（患者 16）中，564 个基因在炎症附近的肿瘤区域和肿瘤实质的其余部分之间差异表达。与实质的其余部分相比，外周炎症附近肿瘤中 MHC I 和 MHC II 的转录水平更高，这表明该区域肿瘤特异性细胞的 TCR 刺激最大。相反，在乳腺癌样本（患者 24）中，MHC I 在包含肿瘤实质的捕获点中高度下调，这可能表明该患者的 CD8⁺T 细胞的肿瘤相关抗原呈递有限。在黑色素瘤样本（患者 16）中，CXCL9、CXCL10、CXCL11 和 CXCL13 以及 TGF-β 在外周较高，这表明该区域的 T 细胞与更深瘤内 T 细胞相比受到独特的趋化因子和细胞因子环境的影响。

大块肿瘤实质和周围组织之间细胞因子和趋化因子表达的差异也是明显的。 例如，TGFB1（编码 TGF-β）在三个样品的基质中富集，而其受体主要在薄壁组织中表达更高。 IFN-γ 受体亚基 IFNGR2 在五个肿瘤中的四个的实质中升高。 VEGFA 和 VEGFB 在所有五种肿瘤的实质中均上调。 鉴于肿瘤中表型和克隆受限的 CD8⁺ T 细胞亚群的差异定位，我们的结果共同表明抗原信号（或缺乏）将这些不同的 CD8⁺ T 细胞亚群驱动到脑转移内的特定壁龛，在那里它们接收明显不同的信号输入.

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Discussion

在这项工作中，描述了人脑转移的 CD8⁺ T 细胞浸润，这是许多癌症类型发病率和死亡率的重要原因。 维持大脑独特的免疫特权环境的血脑屏障 (BBB) 似乎在脑转移瘤中分解。 由此产生的血肿瘤屏障 (BTB) 具有更高的渗透性，但保留了 BBB 的一些特征，并因肿瘤类型而异。 尽管脑转移瘤对 ICB 有一些反应，但理论上，BTB 创造的半特权免疫环境可以限制免疫细胞进入和/或维持进入脑转移瘤 TME。 在这里，我们展示了人脑转移瘤被 CD8⁺ T 细胞充分浸润，尽管浸润程度因患者而异。

我们发现与患者匹配的血液相比，不同的 CD8⁺ T 细胞亚群填充了脑转移。肿瘤内的大多数 CD8⁺ T 细胞是 PD-1⁺，我们的 scRNA-seq 分析将这些 PD-1⁺ 细胞聚集成分裂和终末分化的细胞——它们是克隆相关的——以及两个共享 TCR 重叠的不太耗竭的细胞亚群彼此但不与分裂或终末分化的细胞。总体而言，肿瘤浸润和循环 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞之间的 TCR 重叠较低，这与 HPV+ 头颈癌患者中明显缺乏循环肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞一致。然而，消耗较少的肿瘤浸润细胞确实与循环细胞有有意义的克隆重叠，而终末分化的肿瘤浸润细胞则很少。值得注意的是，我们发现脑转移瘤包含非肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞，这些细胞表达在耗尽的祖细胞群中也发现的标记物，并且在肿瘤浸润和循环 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞中的频率相似。最后，我们将这些表型和克隆受限的 CD8⁺ T 细胞与 TME 内的离散空间偏好联系起来。与耗竭相关的 CD8⁺ T 细胞克隆在肿瘤实质内富集，其中局部细胞因子和趋化因子环境与周围基质显着不同，在那里发现耗竭的 CD8⁺ T 细胞克隆较少。基于这些发现，我们的数据支持一个模型，其中 CD8⁺ T 细胞以不依赖抗原的方式浸润脑转移的 TME。一旦 CD8⁺ T 细胞保留在肿瘤中，抗原信号或缺乏抗原信号就会促使 CD8⁺T 细胞募集到 TME 内的空间生态位。在每个 TME 生态位内，CD8⁺ T 细胞表型随着来自周围细胞因子环境的输入而进化，并且取决于抗原特异性，持续的 TCR 刺激。

这项工作解决的一个关键问题是 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞在人脑转移中的作用。 TCF-1 在癌症和慢性感染小鼠模型中的抗原特异性耗尽祖 CD8⁺ T 细胞上表达，并且 TCF-1 已被用作肿瘤免疫学研究中耗尽祖 CD8⁺ T 细胞的标志物。然而，TCF-1 也在其他 CD8⁺ T 细胞亚群上表达，例如幼稚细胞和记忆细胞。我们发现脑转移灶中的少数 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞共表达 TOX 和 PD-1，这两种蛋白质也在耗尽的肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞上表达。至关重要的是，我们发现有Bystander细胞对渗入脑转移灶的微生物抗原具有特异性，并且这些细胞的一个子集与耗尽的祖 CD8⁺ T 细胞共享表型特征 - 例如 TCF-1 表达。Bystander 克隆在循环和肿瘤浸润的 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞中以相似的频率存在。基于这些数据，我们提出脑转移 TME 中的许多 TCF-1⁺ PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞是Bystander 。由于细胞因子和促炎信号分子的表达增加，而不是通过抗原驱动的过程，这些细胞可能会被募集到肿瘤中。因此，脑转移 TME 中 TCF-1⁺ CD8⁺ T 细胞密度的增加可能表明肿瘤更加发炎，而不是大量肿瘤特异性耗尽的祖 CD8⁺ T 细胞。

分析表明，较少消耗的脑转移浸润 CD8⁺ T 细胞优先保留在肿瘤实质周围的基质中。相比之下，终末分化群体优先位于肿瘤实质内。鉴于Bystander 细胞（采用较少消耗的表型）和终末分化细胞之间的克隆重叠有限，很可能是抗原刺激将终末分化的 PD-1⁺ CD8⁺ T 细胞驱动到肿瘤实质。在肿瘤实质内，与基质内的 CD8⁺ T 细胞相比，这些细胞接收不同的信号输入，可能促进它们获得终末分化表型。例如，我们表明与基质相比，VEGF 表达在肿瘤实质中富集；已发现 VEGF 信号传导可促进 CD8⁺ T 细胞上的 PD-1、CTLA-4、TIM-3 和 TOX 表达。这与我们在终末分化的 CD8⁺ T 细胞上观察到的这些分子的更高表达一致。

在scRNA-seq 数据中鉴定的分裂 CD8⁺ T 细胞metacluster可以代表肿瘤特异性 TCF-1⁺ 耗尽祖细胞和终末分化细胞之间的中间分化状态。人脑转移瘤中的这些分裂细胞与暂时性抗原特异性 CD8⁺ T 细胞共享基因特征，CD8⁺ T 细胞是 T 细胞耗竭的 LCMV 小鼠模型中淋巴驻留的衰竭祖细胞和非淋巴驻留的终末分化细胞之间的中间分化状态.在小鼠肿瘤模型中的工作表明，肿瘤特异性耗尽的祖 CD8⁺ T 细胞存在于肿瘤引流淋巴结中，并且它们与肿瘤浸润、终末分化的 CD8⁺ T 细胞克隆相关。此外，在小鼠模型中维持抗原特异性 CD8⁺ T 细胞需要淋巴结驻留祖细胞迁移到肿瘤；瘤内 TCF-1⁺ 肿瘤特异性细胞不是自我维持的群体。在转移性癌症的情况下，根据疾病的负担，可能有许多肿瘤引流淋巴结的解剖部位，所有这些部位都可能含有肿瘤特异性耗尽的祖 CD8⁺T 细胞。最近描述了一种引流大脑的淋巴系统，并表明颈部淋巴结也可以作为脑转移特异性祖细胞 CD8⁺ T 细胞的储存库。我们的数据并不排除在脑转移 TME 中存在少量肿瘤特异性祖细胞耗竭 CD8⁺ T 细胞，但表明这些其他位点可能是肿瘤特异性耗竭祖细胞的重要储存库。

Our findings have a number of therapeutic implications. First, the dense infiltration of brain metastases by CD8⁺ T cells provides a rational basis for the use and development of immunotherapies in the brain metastasis setting. Next, our data support the use of combination therapies with PD-1 pathway blockade to enhance rescue of exhausted, tumor-specific CD8⁺ T cells by targeting additional inhibitory molecules expressed on brain metastasis-infiltrating terminally-differentiated CD8⁺ T cells, such as CTLA-4 and LAG3. These terminally-exhausted CD8⁺ T cells within the TME may re-gain effector function with PD-1 blockade and/or combination therapies that lead to enhanced tumor cell killing. Finally, targeting the unique signaling niches in which brain metastasis-infiltrating CD8⁺ T cells reside provides an additional opportunity to harness the immune system to improve disease control in the brain. Together our findings support the continued development of immunotherapeutic strategies that harness the anti-tumor efficacy of brain metastasis- infiltrating CD8⁺ T cells.

Method（主要是空间上寻找TCR克隆的方法）

Spatial transcriptomics，看来空间上的TCR克隆也是空间转录组文库的特异性PCR，这个可以参考我之前分享的文章10X空间转录组技术创新之同时测RNA和TCR（BCR）

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