Cufflinks的使用详解之--cuffdiff

Cufflinks下主要包含cufflinks,cuffmerge,cuffcompare和cuffdiff等几支主要的程序。主要用于转录组的组装和差异表达分析。

The Cufflinks RNA-Seq workflow

一、Cuffdiff简介

用于寻找转录子表达的显著性差异。

二、Cuffdiff使用方法

（默认Linux操作，此处省略安装步骤）

cuffdiff主要是发现转录本表达，剪接，启动子使用的明显变化。

Usage:   cuffdiff [options] <transcripts.gtf> <sample1_hits.sam> <sample2_hits.sam> [... sampleN_hits.sam]
   Supply replicate SAMs as comma separated lists for each condition: sample1_rep1.sam,sample1_rep2.sam,...sample1_repM.sam

其中transcripts.gtf是由cufflinks，cuffcompare，cuffmerge所生成的文件，或是由其它程序生成的。一个样本有多个replicate，用逗号隔开。sample多于一个时，cuffdiff将比较samples间的基因表达的差异性。

cuffdiff接受bam/sam或cuffquant的CXB文件，同时也可以接受bam与sam的混合文件，不能接受bam/sam和CXB的混合文件。

三、Cuffdiff参数说明

General Options:
  -o/--output-dir              write all output files to this directory              [ default:     ./ ]    #输出的文件夹目录
  -L/--labels                  comma-separated list of condition labels    #给每个sample一个样品名或者一个环境条件一个lable
  --FDR                        False discovery rate used in testing                  [ default:   0.05 ]    #允许的false discovery rate
  -M/--mask-file               ignore all alignment within transcripts in this file  [ default:   NULL ]    #提供GFF文件。Cufflinks将忽略比对到该GTF文件的transcripts中的reads。该文件中常常是rRNA的注释，也可以包含线立体和其它希望忽略的transcripts的注释。将这些不需要的RNA去除后，对计算mRNA的表达量是有利的。
  -C/--contrast-file           Perform the constrasts specified in this file         [ default:   NULL ]    #比对指定文件
  -b/--frag-bias-correct       use bias correction - reference fasta required        [ default:   NULL ]    #提供一个fasta文件来指导Cufflinks运行新的bias detection and correction algorithm。这样能明显提高转录子丰度计算的精确性。
  -u/--multi-read-correct      use 'rescue method' for multi-reads                   [ default:  FALSE ]    #让Cufflinks来做initial estimation步骤，从而更精确衡量比对到genome多个位点的reads。
  -p/--num-threads             number of threads used during quantification          [ default:      1 ]    #使用的CPU线程数
  --no-diff                    Don't generate differential analysis files            [ default:  FALSE ]    #不需要生成差异分析文件
  --no-js-tests                Don't perform isoform switching tests                 [ default:  FALSE ]    #不需要进行isoform转换测试
  -T/--time-series             treat samples as a time-series                        [ default:  FALSE ]    #让Cuffdiff来按样品顺序来比对样品，而不是对所有的samples都进行两两比对。即第二个SAM和第一个SAM比；第三个SAM和第二个SAM比；第四个SAM和第三个SAM比...
  --library-type               Library prep used for input reads                     [ default:  below ]    #处理的reads具有链特异性。比对结果中将会有个XS标签。一般Illumina数据的library-type为 fr-unstranded。
  --dispersion-method          Method used to estimate dispersion models             [ default:  below ]    #用于估计分散模型的方法
  --library-norm-method        Method used to normalize library sizes                [ default:  below ]    #用于标准化库大小的方法

四、Cuffdiff输出

1. FPKM tracking files

cuffdiff计算每个样本中的转录本，初始转录本和基因的FPKM。其中，基因和初始转录本的FPKM的计算是在每个转录本group和基因group中的转录本的FPKM的求和。

1|isoforms.fpkm_tracking             Transcript FPKMs
2|genes.fpkm_tracking                Gene FPKMs. Tracks the summed FPKM of transcripts sharing each gene_id
3|cds.fpkm_tracking                  Coding sequence FPKMs. Tracks the summed FPKM of transcripts sharing each p_id, independent of tss_id
4|tss_groups.fpkm_tracking           Primary transcript FPKMs. Tracks the summed FPKM of transcripts sharing each tss_id

文件格式：

1|tracking_id class_code  nearest_ref_id  gene_id gene_short_name tss_id  locus   length  coverage    P1_FPKM P1_conf_lo  P1_conf_hi  P1_status   P2_FPKM P2_conf_lo  P2_conf_hi  P2_status   P3_FPKM P3_conf_lo  P3_conf_hi  P3_status
2|ENST00000000233 -   -   ENSG00000004059 ARF5    -   7:127220671-127242198   1103    -   58.3768 0   139.888 OK  47.3478 0   113.046 OK  78.9705 0   184.419 OK

注：P1、P2、P3为样本名

2. Count tracking files

评估每个样本中来自每个 transcript, primary transcript, and gene的fragment数目。其中primary transcript, and gene的fragment数目是每个primary transcript group或gene group中trancript的数目之和。

1|isoforms.count_tracking             Transcript counts
2|genes.count_tracking                Gene counts. Tracks the summed counts of transcripts sharing each gene_id
3|cds.count_tracking                  Coding sequence counts. Tracks the summed counts of transcripts sharing each p_id, independent of tss_id
4|tss_groups.count_tracking           Primary transcript counts. Tracks the summed counts of transcripts sharing each tss_id

文件格式：

1|tracking_id P1_count    P1_count_variance   P1_count_uncertainty_var    P1_count_dispersion_var P1_status   P2_count    P2_count_variance   P2_count_uncertainty_var    P2_count_dispersion_var P2_status   P3_count    P3_count_variance   P3_count_uncertainty_var    P3_count_dispersion_var P3_status
2|ENST00000000233 1226.79 733396  0   591186  OK  992.56  474498  0   376391  OK  1661.82 1.22994e+06 0   1.22994e+06 OK

3. Read group tracking files

计算在每个repulate中每个transcript， primary transcript和gene的表达量和frage数目。

1|isoforms.read_group_tracking      Transcript read group tracking
2|genes.read_group_tracking         Gene read group tracking. Tracks the summed expression and counts of transcripts sharing each gene_id in each replicate
3|cds.read_group_tracking           Coding sequence FPKMs. Tracks the summed expression and counts of transcripts sharing each p_id, independent of tss_id in each replicate
4|tss_groups.read_group_tracking    Primary transcript FPKMs. Tracks the summed expression and counts of transcripts sharing each tss_id in each replicate

文件格式：

1|tracking_id condition   replicate   raw_frags   internal_scaled_frags   external_scaled_frags   FPKM    effective_length    status   
2|ENST00000000233 MofRCC  1   1307.38 1182.81 1182.81 56.4898 -   OK

4. Differential expression test files

对于splicing transcript，primary transcripts, genes, and coding sequences.样本之间的表达差异检验。对于每一对样本x和y，都会有以下四个文件：

1|isoform_exp.diff                  Transcript differential FPKM.
2|gene_exp.diff                     Gene differential FPKM. Tests difference sin the summed FPKM of transcripts sharing each gene_id
3|tss_group_exp.diff                Primary transcript differential FPKM. Tests differences in the summed FPKM of transcripts sharing each tss_id
4|cds_exp.diff                      Coding sequence differential FPKM. Tests differences in the summed FPKM of transcripts sharing each p_id independent of tss_id

文件格式：

1|test_id gene_id gene    locus   sample_1    sample_2    status  value_1 value_2 log2(fold_change)   test_stat   p_value q_value significant
2|ENST00000000233 ENSG00000004059 ARF5    7:127220671-127242198   MofRCC  NofRCC  OK  58.3768 47.3478 -0.302097   -0.212748   0.7584  0.992833    no

5. Differential splicing tests – splicing.diff

对于每个primary transcript，鉴定的不同的isoform的差异性。只有2个或2个以上的isoforms的primary transcript存在。
文件格式：

1|test_id gene_id gene    locus   sample_1    sample_2    status  value_1 value_2 sqrt(JS)    test_stat   p_value q_value significant

6. Differential coding output – cds.diff

对于每个基因，它的cds的鉴定。样本间的输出cds的差异性。只有2个或2个以上的cds（multi-protein genes）列举在文件中。
文件格式：

1|test_id gene_id gene    locus   sample_1    sample_2    status  value_1 value_2 sqrt(JS)    test_stat   p_value q_value significant

7. Differential promoter use – promoters.diff

样本间启动子使用的差异性。只有表达2个或2个以上isoform的基因列举在这里。
文件格式：

1|test_id gene_id gene    locus   sample_1    sample_2    status  value_1 value_2 sqrt(JS)    test_stat   p_value q_value significant

8. Read group info – read_groups.info

每个repulate，在进行定量分析时，cuffdiff的关键属性会列出。
文件格式：

1|file    condition   replicate_num   total_mass  norm_mass   internal_scale  external_scale
2|/PROJ/*/Quantification/P1/abundances.cxb    MofRCC  0   2.8904e+07  2.44127e+07 1.20839 1

9. Run info – run.info

运行信息。