注意：版本不同，命令会不一致。一定要用对应的版本。
需要登录google账户 GATK3的下载地址
GATK4 各个版本之间，有些命令会有变化。
1.GATK的安装、使用
别人的教程
腾讯云的教程
GATK4数据预处理
变异检测(BWA+SAMtools+picard+GATK)
bwa+samtools+picardtools+GATK call SNP 流程
因我们服务器渣渣的网络问题，内容都是下载到本地的win10之后，再上传到服务器上。
服务器配置：cpu 4个6核2线程=48 内存：396G
gatk是Java程序，下载到本地后解压缩即可使用。在win10使用IDM下载gatk4.0.10.1地址
存放目录
/home/chaim/disk/gatk/
unzip gatk4.0.10.1
cd gatk4.0.10.1/
chmod 777 gatk
./gatk --list //显示gatk的所有子命令
2.GATK4.0.10.1简介
常用的pipeline有5种
Germline SNPs + Indels
种系SNP+IndelSomatic SNVs + Indels
体细胞单碱基突变RNAseq SNPs + Indels
Germline CNVs
种系拷贝数变异
(Copy numbervariations, CNVs)主要指大于1kb 以上的DNA片段的缺失、插入、重复等。一般是结构性变异Somatic CNVs
体细胞拷贝数变异
1、2、4、5适合DNA测序分析，3适合RNA测序分析。’
官方文档开始分析
GATK4.0全基因组和外显子组分析实战
软件：
- fastqc检测质量
- fastq/trimmomatic质控
- bwa比对
- samtool格式转换
数据存放位置
所有数据环境前提是在/home/chaim/disk/BSA/目录
该目录文件有
119-8-1 //119-8测序原始数据1
-A23-16551278-1279119-8_combined_R1.fastq.gz
-A23-16551278-1279119-8_combined_R2.fastq.gz
119-8-2 //119-8测序原始数据2
-A23-16551278-1279-119-8_combined_R1.fastq.gz
-A23-16551278-1279-119-8_combined_R2.fastq.gz
origin
- B17SF2447-20_L1_358358.R1.clean.fastq_2.gz
- B17SF2447-20_L2_358358.R1.clean.fastq.gz
- B17SF2447-20_L1_358358.R2.clean.fastq.gz
- B17SF2447-20_L2_358358.R2.clean.fastq.gz
//四个原始数据
1. 质控检测
fastqc *.fastq.gz -t 8 -o fastqc_out/
安装fastp
wget http://opengene.org/fastp/fastp
chmod 755 fastp
使用fastp质控数据
~~据传，fastp比trimmomatic速度快，效果好。姑且信之。
./fastp -i in.R1.fq.gz -o out.R1.fq.gz -I in.R2.fq.gz -O out.R2.fq.gz
#运行目录于/BSA/119-8 质控119-8的数据
../origin/fastp -i ../119-8-1/A23-16551278-1279119-8_combined_R1.fastq.gz -o ./fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz -I ../119-8-1/A23-16551278-1279119-8_combined_R2.fastq.gz -O ./fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &
../origin/fastp -i ../119-8-2/A23-16551278-1279-119-8_combined_R1.fastq.gz -o ./fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz -I ../119-8-2/A23-16551278-1279-119-8_combined_R2.fastq.gz -O ./fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &
#运行于/BSA/origin/
./fastp -i ./B17SF2447-20_L1_358358.R1.clean.fastq.gz -o ./fastp_out/2447-20_L1$.R1.clean.fastq.gz -I ./B17SF2447-20_L1_358358.R2.clean.fastq.gz -O ./fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &
./fastp -i ./B17SF2447-20_L2_358358.R1.clean.fastq.gz -o ./fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz -I ./B17SF2447-20_L2_358358.R2.clean.fastq.gz -O ./fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &
fastp参数参考地址
-i R1输入双端测序数据的R1端
-o outputR1质控后输出的R1端
-I R2输入R2原始测序数据
-O outputR2质控后输出的R2端
-Q禁用质量过滤
--thread=5设置线程数为5
--length_required=50设置过滤的最短的序列长度50bp
--n_base_limit=6一个reads中N的次数大于6，则舍弃该reads
--compression=6输出的gzip文件压缩程度为6，1-9，压缩程度加大。
2.1. bwa建立索引文件
/bwa的命令一定不要使用nohup。nohup 的输出信息会被bwa输出到目标文件，会影响后续步骤/
B73序列地址位置
/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa
/BSA/bwa/zm437软连接到上述文件
//工作目录/BSA/bwa/
bwa index -a bwtsw -p zm437 /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa
index -a bwtsw设置模式，适合大基因组
-p zm437设置输出文件名
################分割线#####################################
/#注意：此处的2.2.1和2.2.2这两步的bwa 一定要用同一版本的bwa，不然后面会报错/
2.2和2.3二选一即可，建议使用2.3. bwa的mem的效率更高，且更加准确。
2.2 bwa寻找输入reads文件的SA坐标
//工作目录/BSA/bwa/
bwa aln zm437 read1.fq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I > read1.fq.gz.sai
bwa aln zm437 read2.fq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I > read2.fq.gz.sai
//前4个是本次2447-20样品
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I >2447-20_L1.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I >2447-20_L1.R2.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I >2447-20_L2.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I >2447-20_L2.R2.fq.gz.sai &
//后4个是119-8的数据
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I >119-8_1.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I >119-8_1.R2.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I >119-8_2.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz -l 30 -k 2 -t 8 -I >119-8_2.R2.fq.gz.sai &
2.2.2 sai转sam
bwa sampe -r "@RG\tID:<ID>\tLB:<LIBRARY_NAME>\tSM:<SAMPLE_NAME>\tPL:ILLUMINA" read1.fq.gz.sai read2.fq.gz.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam
注释：SAMPLE_NAME应替换为对应样品名称，否则会被当做一个样品处理。
//2447-20数据
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:2447-20\tLB:B73\tSM:2447-20_L1\tPL:ILLUMINA" 2447-20_L1.R1.fq.gz.sai 2447-20_L1.R2.fq.gz.sai ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L1.sam &
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:2447-20\tLB:B73\tSM:2447-20_L2\tPL:ILLUMINA" 2447-20_L2.R1.fq.gz.sai 2447-20_L2.R2.fq.gz.sai ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L2.sam &
//119-8数据
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:119-8\tLB:B73\tSM:119-8_1\tPL:ILLUMINA" 119-8_1.R1.fq.gz.sai 119-8_1.R2.fq.gz.sai ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz >119-8_1.sam &
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:119-8\tLB:B73\tSM:119-8_2\tPL:ILLUMINA" 119-8_2.R1.fq.gz.sai 119-8_2.R2.fq.gz.sai ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz >119-8_2.sam &
2.3 BWA的mem的使用，好用快速一步到位。参考地址(注意2.2和2.3，二选一即可，建议使用2.3)
#bwa mem的使用
/*工作目录在/home/chaim/disk/BSA/bwa/*/
/*zm437是B73基因组序列*/
/*比对的参数-R一定不能省略或写错*/
bwa mem -t 24 -M -P -R '@RG\tID:2447-20\tSM:2447-20\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L1.sam &
bwa mem -t 24 -M -P -R '@RG\tID:2447-20\tSM:2447-20\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L2.sam &
bwa mem -t 12 -M -P -R '@RG\tID:119-8\tSM:119-8\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz >119-8_1.sam &
bwa mem -t 8 -M -P -R '@RG\tID:119-8\tSM:119-8\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz >119-8_2.sam &
3. 对Sam文件进行重排序(recorder)
下载安装最新版picard
保存到路径/home/chaim/disk/BSA/bwa/
在该路径运行java -jar picard.jar -h,会列出picard包含的所有工具。
3.1 构建索引序列
nohup samtools faidx zm437 &
3.2对Sam文件进行重排序
java -jar picard.jar CreateSequenceDictionary R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa O=zm437.dict
java -jar picard.jar ReorderSam I=2447-20_L1.sam O=2447-20_L1.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &
java -jar picard.jar ReorderSam I=2447-20_L2.sam O=2447-20_L2.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &
java -jar picard.jar ReorderSam I=119-8_1.sam O=119-8_1.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa
java -jar picard.jar ReorderSam I=119-8_2.sam O=119-8_2.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &
4.将sam文件转换成bam文件。
samtools view --threads 24 -bS 2447-20_L1.reordered.sam -o 2447-20_L1.bam &
samtools view --threads 24 -bS 2447-20_L2.reordered.sam -o 2447-20_L2.bam &
samtools view --threads 8 -bS 119-8_1.reordered.sam -o 119-8_1.bam
samtools view --threads 8 -bS 119-8_2.reordered.sam -o 119-8_2.bam &
5. 对bam文件进行sort排序
java -jar picard.jar SortSam INPUT=2447-20_L1.bam OUTPUT=2447-20_L1.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &
java -Xmx48G -jar picard.jar SortSam INPUT=2447-20_L2.bam OUTPUT=2447-20_L2.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &
java -Xmx96G -jar picard.jar SortSam INPUT=119-8_1.bam OUTPUT=119-8_1.sort.bam SORT_ORDER=coordinate
java -jar picard.jar SortSam INPUT=119-8_2.bam OUTPUT=119-8_2.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &
6. Merge
\\合并一个样本的多个lane的bam文件。
java -jar picard.jar MergeSamFiles I=2447-20_L1.sort.bam I=2447-20_L2.sort.bam O=2447-20.bam &
java -jar picard.jar MergeSamFiles I=119-8_1.sort.bam I=119-8_2.sort.bam O=119-8.bam
7. Duplicates Marking
一般情况是RNA-seq不需要这一步，chip-seq,dap-seq,call snp需要这一步骤。
具体原理
测序原理是随机打断，那么理论上出现两条完全相同的read的概率是非常低的，而且建库时PCR扩增存在偏向性，因此标出完全相同的read。
java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES= false MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 INPUT=2447-20.bam OUTPUT=2447-20.repeatmark.bam METRICS_FILE=2447-20.bam.metrics
java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES= false MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 INPUT=119-8.bam OUTPUT=119-8.repeatmark.bam METRICS_FILE=119-8.bam.metrics
8. 生成上一步的结果的索引文件
samtools index 2447-20.repeatmark.bam
samtools index 119-8.repeatmark.bam
/#因前面的bwa的mem的R参数，我第一次运行时未设置完整，导致此处需要二次更改头文件*/
使用picard更改头文件
ID str：输入reads集ID号；LB：read集文库名；PL：测序平台（illunima或solid）；PU：测序平台下级单位名称（run的名称）；SM：样本名称。
java -Xmx96g -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups I=2447-20.repeatmark.bam O=2447-20.repeat.bam LB=lib2447-20 PL=illumina PU=2447-20 SM=2447-20 &
java -Xmx96g -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups I=119-8.repeatmark.bam O=119-8.repeat.bam LB=lib119-8 PL=illumina PU=119-8 SM=119-8 &
/一定不要手动加头文件，手动的后续无法识别。/
9.Base (Quality Score) Recalibration
Tools involved: BaseRecalibrator, Apply Recalibration, AnalyzeCovariates (optional)
参考地址
流程参考地址
碱基质量分数重校准（Base quality score recalibration，BQSR)，就是利用机器学习的方式调整原始碱基的质量分数。它分为两个步骤:
- 利用已有的snp数据库，建立相关性模型，产生重校准表( recalibration table)
- 根据这个模型对原始碱基进行调整，只会调整非已知SNP区域。
参数列表
-R ： 参考基因组
-I ： 输入的BAM文件
--known-sites 已知SNP的vcf文件
-O ： 输出的重校准表
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar BaseRecalibrator -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20.repeat.bam --known-sites /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf -O 2447-20_recal_data.table &
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyBQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20.repeat.bam -bqsr 2447-20_recal_data.table -O 2447-20_recal_reads.bam &
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar BaseRecalibrator -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8.repeat.bam --known-sites /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf -O 119-8_recal_data.table &
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyBQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8.repeat.bam -bqsr 119-8_recal_data.table -O 119-8_recal_reads.bam &
#检测上述生成的bam文件是否可用。
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ValidateSamFile -I 2447-20_recal_reads.bam
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ValidateSamFile -I 119-8_recal_reads.bam
如果显示no errors found,则可以用HaplotypeCaller call SNP/Indel.
二、GATK变异检测
参考教程地址
说明：后续会有部分命令有-nt 24这个参数，代表使用24个进程。并不是每一个命令都可以开多进程的，需要到gatk官网查询文档，搜索命令后，在命令的API文档里搜索thread即可快速查找是否能使用多线程
（这一步在V4.1.4.0中，java的内存分配最好不要超过16g,建议8g足够。hmm进程也少设置点4-8个。如果Java内存设置太高，某些服务器即使在服务器内存范围也会出错会因为内存分配不足而中途挂掉程序，如果中途挂掉，同样有修复办法。picard修复中断的gvcf文件）
1.生成raw vcf 文件（3-5天能跑完的，都是大服务器）
参数说明
先用HaplotypeCaller生成gvcf文件，然后再运行CombineGVCFs。
java -Xmx96G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar \ #Xmx96G 使用的最大内存
HaplotypeCaller \ #使用HaplotypeCaller模式，比较吃配置
-R /home/chaim/disk/BSA/bwa/zm437 \ #参考B73基因组
-I 2447-20.repeatmark.bam \ #若多样品，则-I sample1.bam -I sample2.bam
--dbsnp zm437vcf \ #参考B73的snp
-stand_emit_conf 10
-stand_call_conf 30
-O 2447-20.vcf
1.1生成Gvcf文件（此步非常浪费时间，需要多（3-5）个昼夜）
java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar HaplotypeCaller -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8_recal_reads.bam --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --native-pair-hmm-threads 96 -stand-call-conf 30 -O 119-8.g.vcf.gz -ERC GVCF
java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar HaplotypeCaller -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20_recal_reads.bam --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --native-pair-hmm-threads 96 -stand-call-conf 30 -O 2447-20.g.vcf.gz -ERC GVCF
1.2合并之前生成的GVCF文件到一个文件。
java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar CombineGVCFs -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --variant 2447-20.g.vcf.gz --variant 119-8.g.vcf.gz -O cohort.g.vcf.gz
1.3 GenotypeGVCFs
java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar GenotypeGVCFs -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V cohort.g.vcf.gz -O common.vcf.gz
2.select SNP
java -Xmx96g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar SelectVariants -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -O common_SNP.vcf --variant common.vcf.gz --select-type-to-include SNP 2>select_snp.err
3.select indel
java -Xmx96g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar SelectVariants -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -O common_INDEL.vcf --variant common.vcf.gz --select-type-to-include INDEL 2>select_indel.err
/#4.1和4.2变异过滤，是不同算法的过滤。4.1是机械参数过滤，4.2是机器学习过滤。二者选一即可/
4.1 filter SNP（变异过滤，硬过滤。）参数讲解
java -Xmx4g -jar $GATK -R $REF -T VariantFiltration --variant $Slect_SNP --clusterSize 4 --clusterWindowSize 10 --maskName aroundIndel --mask $Slest_INdel -maskExtend 3 --filterName "lowMQRankSum" --filterExpression "MQRankSum < -12.5" --filterName "highFS" --filterExpression "FS > 60.0" --filterName "lowReadPosRankSum" --filterExpression "ReadPosRankSum < -8.0" --filterName "lowMQ" --filterExpression "MQ < 40.0" --filterName "lowQD" --filterExpression "QD < 2.0" --out $Filter_SNP --genotypeFilterName "lowDP" --genotypeFilterExpression "DP < 8.0" >filter_snp.err
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar VariantFiltration -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa --variant common_SNP.vcf --cluster-size 4 --cluster-window-size 10 --mask-name aroundIndel --mask common_INDEL.vcf -mask-extension 3 --filter-name "lowMQRankSum" --filter-expression "QUAL < 30" --filter-name "qua130" --filter-expression "MQRankSum < -12.5" --filter-name "highFS" --filter-expression "FS > 60.0" --filter-name "lowReadPosRankSum" --filter-expression "ReadPosRankSum < -8.0" --filter-name "lowMQ" --filter-expression "MQ < 40.0" --filter-name "lowQD" --filter-expression "QD < 2.0" -O common_filtration.vcf --genotype-filter-name "lowDP" --genotype-filter-expression "DP < 8.0" >filter_snp.err
参数详解（参考）
以下的过滤参数可以根据自己的实际vcf的值分布，自己修改。
QD,描述单位深度的变异值，越大可信度越高。一般过滤掉<2的值。
FS，描述正负链特异性，差异性较大，说明测序或组装的过程中不够随机。FS越小越好。一般过掉掉>40（严格）或60（普通）
MQ 使用bwa-mem的话，正常值应该是60，描述某个位点测序reads的质量值的离散程度。MQ< 40.0
MQRankSum < -12.5
SOR，也是表示正负链特异性，正常值在0-3，过滤掉>3的值。
4.2 变异质控VQSR,共分为两步（##此步本实验不适用，未运行。）
/本此实验不能使用该模型过滤，该模型适应于多样本的vcf质控/
- VariantRecalibrator
构建重新校准模型以评估变体质量以进行过滤
（VariantRecalibrator） - 变异质量得分重新校准ApplyVQSR
- VariantRecalibrator
VariantRecalibrator
gatk VariantRecalibrator \
-R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
-V input.vcf.gz \
--resource hapmap，known = false，training = true，truth = true，prior = 15.0：hapmap_3.3.hg38.sites.vcf.gz \
--resource omni，known = false，training = true，truth = false，prior = 12.0：1000G_omni2.5.hg38.sites.vcf.gz \
--resource 1000G，known = false，training = true，truth = false，prior = 10.0：1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz \
--resource dbsnp，known = true，training = false，truth = false，prior = 2.0：Homo_sapiens_assembly38.dbsnp138.vcf.gz \
-an QD -an MQ -an MQRankSum -an ReadPosRankSum -an FS -an SOR \
-mode SNP
-O output.recal \
--tranches-file output.tranches \
--rscript-file output.plots.R
VQSR
gatk ApplyVQSR \
-R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
-V input.vcf.gz \
-O output.vcf.gz \
--truth-sensitivity-filter-level 99.0 \
--tranches-file output.tranches \
--recal-file output.recal \
-mode SNP
java -Xmx128g jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyVQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V 2447-20.vcf -O 2447-20.vqsr.vcf &
java -Xmx128g jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyVQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V 119-8.vcf -O 119-8.vqsr.vcf &
- 转换vcf为table格式
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar VariantsToTable -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V common_filtration.vcf -F CHROM -F POS -F REF -F ALT -GF AD -GF DP -GF GQ -GF PL -O common.table
三、使用qtl-seqr包（可以和第四步同时进行）
QTLseqr在github
以下代码为R语言代码
#安装使用QTL-seqr
#安装
installed.packages('devtools')
library('devtools')
install_github("bmansfeld/QTLseqr")
#load the package
library("QTLseqr")
#set sample and file name
HighBulk <- "样品名称1"
LowBulk <- "样品名称2"
file <- "common.table"
#choose which chromosomes will be included in the analysis
chroms <- paste0
Chroms <- paste0(rep("Chr", 10), 1:10)
#Import SNP data from file
df <-
importFromGATK(
file = file,
highBulk = HighBulk,
lowBulk = LowBulk,
chromList = Chroms
)
#Filter SNPs based on some criteria
df_filt <-
filterSNPs(
SNPset = df,
refAlleleFreq = 0.20,
minTotalDepth = 100,
maxTotalDepth = 400,
minSampleDepth = 40,
minGQ = 99
)
#Run G' analysis
df_filt <- runGprimeAnalysis(
SNPset = df_filt,
windowSize = 1e6,
outlierFilter = "deltaSNP")
#Run QTLseq analysis
df_filt <- runQTLseqAnalysis(
SNPset = df_filt,
windowSize = 1e6,
popStruc = "F2",#根据群体结构调整F2或者RIL
bulkSize = c(25, 25),#根据池中的样本单株数量
replications = 10000,
intervals = c(95, 99)
)
#Plot
plotQTLStats(SNPset = df_filt, var = "Gprime", plotThreshold = TRUE, q = 0.01)
plotQTLStats(SNPset = df_filt, var = "deltaSNP", plotIntervals = TRUE)
#export summary CSV
getQTLTable(SNPset = df_filt, alpha = 0.01, export = TRUE, fileName = "my_BSA_QTL.csv")
四. 使用snpEff处理gatk4输出的vcf。（此步骤和第三步骤的输出结果可以互相对比，两者具有相同的功能）
snpEff的教程
-
下载snpEff地址
解压unzip snpEff_latest_core.zip
我的路径是/home/chaim/bsa/snpEff/ - 配置玉米zm437版本的数据库
在路径/home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/目录下创建文件夹data,
cd /home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/
mkdir data
cd data
mkdir genomes
mkdir zm437
#在zm437目录存放基因组注释文件genes.gff, 蛋白库，protein.fa
#在genomes目录放置基因组参考序列 zm437.fa
注意上述的基因组注释文件是gff3格式。
修改snpEff.config的参数
添加如下内容
#maize genome,version zm437
zm437.genome:maize
回到snpEFF目录，运行命令
java -jar snpEff.jar build -gff3 -v zm437
- 对vcf格式文件进行注释：
bwa目录存放着GATK4处理之后的文件common_filtration.vcf
在/home/chaim/bsa/bwa目录执行下面命令
java -Xmx128g -jar /home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/snpEff.jar zm437 common_filtration.vcf > common.eff.vcf
会输出三个文件，
snpEff_genes.txt
snpEff_summary.html
common.eff.vcf
- 如果想更改使用其他注释文件，
删除/home/chaim/bsa/snpEff/snpEff//data/zm437/snpEffectPredictor.bin该文件删除即可。
重新从步骤1开始即可。
