在之前的文章里，我主要讲了如下两个内容：(1) 认识Cell Hashing；(2): 使用Cell Ranger得到表达矩阵。相信大家已经知道了cell hashing与普通10X转录组的差异，以及使用cellranger得到表达矩阵。

这一篇讲如何使用Seurat的HTODemux函数，CiteFuse的crossSampleDoublets函数两种方法拆分表达矩阵（混了不同来源的细胞），最后还会略微比较一下两种方法得到的结果的差异。

HTODemux

这种方法的原理我在第一篇笔记中已经讲过，感兴趣的小伙伴可以看之前的文章。主要R代码如下：

library(Seurat)
library(ggplot2)
library(tidyverse)
args <- commandArgs(TRUE)

加载R包，导入外部参数，args[1]表示样本名称，args[2]表示ensembl_ID和基因symbol对应关系的文本文件，前面得到的表达矩阵行名是ensembl_ID，为了在后续可视化的时候更省事，建议在这一步更换基因名称。

df <- read.table(paste(args[1],".mat.count.txt",sep = ""),header = T,row.names = 1) #df的行数包括基因和tag
colnames(df) <- str_replace(colnames(df),"\\.1","")
ensembl_symbol <- read.table(args[2],header = F,row.names = 1,stringsAsFactors = F)
df1 <- df[intersect(rownames(ensembl_symbol),rownames(df)),] #提取出基因表达矩阵
df2 <- df[setdiff(rownames(df),rownames(ensembl_symbol)),] #提取出tag表达矩阵
rownames(df1) <- ensembl_symbol[rownames(df1),] #更换基因表达矩阵的行名

接下来利用df2数据框的信息拆分，df2行为tag，列为cellular barcode

cellhash <- CreateSeuratObject(counts = df2,project = "cell_hashing", assay = "HTO")
cellhash <- NormalizeData(cellhash, assay = "HTO", normalization.method = "CLR")
cellhash <- HTODemux(cellhash, assay = "HTO", positive.quantile = 0.85) 

最后一步就是拆分，第一篇笔记说过，positive.quantile参数表示在拟合负二项分布之后使用什么分位数来判断UMI是相对大还是相对小，默认值是0.99，实际处理时，发现这个值可能并不合理，比如最终拆分出来的有效细胞数、不同来源细胞数比例和预期差别很大，再比如从图形上看，明显不对（下文有图形说明）。
这一步之后，每一个CB都会带上一个标签，比如我的数据只有两个样本来源，标签会有这4种：Negative、tag6_tag7、tag6、tag7，前面两个表示空液滴、(跨样本的)doublet。

Idents(cellhash) <- "HTO_classification"
FeatureScatter(cellhash, feature1 = paste("hto_",rownames(cellhash)[1],sep=""),
               feature2 = paste("hto_",rownames(cellhash)[2],sep = ""),slot = "counts")

HTOHeatmap(cellhash, assay = "HTO")

上面两个图，可以用来检验拆分的质量，第一张每个点的横纵坐标表示每个CB两个tag的UMI，第二张图的每一列表示每个CB两个tag的标准化之后的表达量。
然后根据每个CB的标签提取出有效的singlet就可以了。

small_df1 <- df1[,colnames(cellhash)[cellhash$HTO_classification==rownames(cellhash)[1]]]
write.table(small_df1,paste(args[1],"_",rownames(cellhash)[1],".mat.count.txt",sep = ""),quote = F,row.names = T,col.names = T,sep="\t")
small_df2 <- df1[,colnames(cellhash)[cellhash$HTO_classification==rownames(cellhash)[2]]]
write.table(small_df2,paste(args[1],"_",rownames(cellhash)[2],".mat.count.txt",sep = ""),quote = F,row.names = T,col.names = T,sep="\t")

除了上面两种Seurat自带图形，下面两种图形也很有参考意义，代码就先不放了，如有需要可以在公众号后台小窗我。

将UMI取对数之后做图，可以从另一个角度看结果，可以看到右上角被HTODemux认定为doublet的CB，像是包含了本应该是singlet的CB。我尝试过positive.quantile用默认值0.99，这种现象会更明显，所以我觉得在做这一步的时候，可以画画这个图，选择一个适中的positive.quantile值。

crossSampleDoublets

CiteFuse包在做这一步的时候，是从取对数之后的UMI矩阵开始的，分别从两个维度拟合正态分布，因此最终得到的结果在散点图上，比上一种方法更说得过去。示意图如下：

具体使用的R代码如下：

library(tidyverse)
library(ggplot2)
library(SingleCellExperiment)
library(CiteFuse)
args <- commandArgs(TRUE)

allexp <- read.table(paste(args[1],".mat.count.txt",sep = ""),header = T,row.names = 1)
colnames(allexp) <- str_replace(colnames(allexp),"\\.1","")
allexp_sce <- preprocessing(exprsMat = as.matrix(allexp)) #生成特定的对象
is.HTO <- grepl("^tag[123678]", rownames(allexp_sce)) #根据自己的tag命名修改正则表达式
allexp_sce <- splitAltExps(allexp_sce, ifelse(is.HTO, "HTO", "gene")) #给每一行加一个标签，HTO或者gene

allexp_sce=normaliseExprs(allexp_sce, altExp_name = "HTO", exprs_value = "counts",transform = c("log")) #仅针对HTO行，取对数
allexp_sce=crossSampleDoublets(allexp_sce,altExp_name = "HTO",totalExp_threshold = 10) 

最后一行就是拆分关键步骤，会给每个CB一个标签，totalExp_threshold表示只会保留表达数大于10的CB。

ensembl_symbol <- read.table("/ref/10x/Ensembl_symbol_new.txt",header = F,row.names = 1,stri
ngsAsFactors = F)
df1 <- allexp[intersect(rownames(ensembl_symbol),rownames(allexp)),]
df2 <- allexp[setdiff(rownames(allexp),rownames(ensembl_symbol)),]
rownames(df1) <- ensembl_symbol[rownames(df1),]

tmp1=as.data.frame(t(df2))
tmp2=as.data.frame(allexp_sce$doubletClassify_between_label)
colnames(tmp2)="anno"
tmp2$anno=as.character(tmp2$anno)

crossSampleDoublets返回的标签不容易识别，比如1、2，还需要重新更换名称，如下

for (i in seq(1,length(rownames(tmp2)),1)) {
  for (j in seq(1,length(colnames(tmp2)),1)) {
    if (tmp2[i,j] == "1") {
      tmp2[i,j] = colnames(tmp1)[1]
    }
    if (tmp2[i,j] == "2") {
      tmp2[i,j] = colnames(tmp1)[2]
    }
    if (tmp2[i,j] == "doublet/multiplet") {
      tmp2[i,j] = "doublet"
    }
  }
}

df_point=cbind(tmp1,tmp2)
colnames(df_point)=c("taga","tagb","anno")

这一步之后就能根据tag标签画散点图，以及提取想要的矩阵了。

实际处理中，上面两种方法我都用了，最后选了二者交集的CB来提取矩阵（相对保险的做法）。这一步在cell hashing数据的处理中可以说是相当重要了，如果拆分质量不过关，错误地将不同来源的细胞划分到一个矩阵中，对后续分析结果影响很大。
上述代码只呈现了拆分的关键步骤，详细的画图代码没有放上来，如果需要可以在微信后台私信我。
因水平有限，有错误的地方，欢迎批评指正！