写这个记录的缘由，是我在生信技能树上看到这样一篇文章：

在《Single-cell analyses reveal increased intratumoral heterogeneity after the onset of therapy resistance in small-cell lung cancer》这篇文章中，作者将10x Genomics单细胞测序的数据上传到了GEO: GSE138267。但当我们想从 ENA 数据库下载相应的.fastq原始数据时，却发现每个 RUN 只有一个.fastq文件：

（上图中 SRR10211576 甚至没有提供.fastq文件……）

由于现在10x Genomics 的 Cellranger 流程要求输入的.fastq文件至少有R1（cell barcode和UMI序列）和 R2（插入片段），直接从 ENA 下载的单个.fastq显然不能用于 CellRanger，必须另找办法。

1. 探索 Run Browser

我们在 SRA 的 Run Browser 中随便查看一下 SRR10211573 的基本信息：

可以看到每个 spot 的 read 由三部分组成。你如果足够熟悉10x Genomics的文库结构，根据碱基长度，就不难推测它们分别是R1（26bp：cell barcode和UMI序列）、R2（98bp：插入片段）和I1（8bp：index序列）

我们注意到下面的 Show 2 additional attributes，点开后可以看到fastq-load.py及其参数：

经过谷歌搜索，我们发现fastq-load.py来自 ngs-tools，是一个提供给研究者用于上传数据到 SRA 的工具：

fastq-load.py --output=<archive path> <other options> <fastq files> | general-loader

我没有细看 github 上的源代码，根据输出结果中的<archive path>推测它是把多个.fastq文件合并成一个.sra文件。那么理论上说完整的.sra文件里应该包含完整的三部分 reads，利用sra-toolkit中的fastq-dump提取出这些文件并用于 Cellranger！

2. sra-toolkit

配置sra-docker

这里我搭建了一个 docker 镜像：yuchenlee/sra-toolkit:2.10.8：

docker pull yuchenlee/sra-toolkit:2.10.8

利用prefetch下载.sra文件：

docker run --rm \
  -v /home/lyc/lyc-1995/ncbi/:/home/mydocker/ncbi/ \
  --user=1000 \
  yuchenlee/sra-toolkit:2.10.8 \
  prefetch SRR10211573 --max-size 50000000

挂载宿主机目录时最后一个文件夹要命名为ncbi，数据默认会下载到ncbi/sra。搭建镜像的时候我忘了在里面配置aspera了，下载速度有点慢……

利用fastq-dump提取 reads 文件：

docker run --rm \
  -v /home/lyc/lyc-1995/ncbi/:/home/mydocker/ncbi/ \
  --user=1000 \
  yuchenlee/sra-toolkit:2.10.8 \
  fastq-dump --split-files --gzip --outdir ./ncbi/fastq  SRR10211573

得到了 3 个.fastq.gz文件，对应 Run Browser 中的 reads per spot：

cd ~/lyc-1995/ncbi/fastq/
tree -hl

.
├── [6.8G]  SRR10211573_1.fastq.gz
├── [21.3G]  SRR10211573_2.fastq.gz
└── [3.1G]  SRR10211573_3.fastq.gz

0 directories, 3 files

其实从文件大小也大致能看出三者的关系来了。

3. Cellranger

按照 Cellranger 的要求重命名：

mv SRR10211573_1.fastq.gz SC16-LB17028_S1_L001_R1_001.fastq.gz
mv SRR10211573_2.fastq.gz SC16-LB17028_S1_L001_R2_001.fastq.gz
mv SRR10211573_3.fastq.gz SC16-LB17028_S1_L001_I1_001.fastq.gz

就可以愉快地跑 cellranger count啦！

4. ENA 和 SRA 不一致

在源代码中查看fastq-load.py的参数--readTypes=TBT：

--readTypes: 

For specifying read types using B (Biological) or T (Technical) 
Use sequence like TBBT - no commas. Defaults to BB. Must be 
consistent with number of values specified for read lengths. 
If you want the read sequence to be used as the spot group or 
part of the spot group use G (Group). Multiple reads incorporated 
into the spot group will be concatenated with an '_' separator.

在我们这个例子中，R2是Biological reads，R1和I1都是Technical reads。我猜测 ENA 在同步 SRA 中的数据时，默认只同步Biological reads，这可能就是为什么我们直接从 ENA 下载数据只得到一个.fastq。而且在fastq-dump参数中，也有选择丢弃Technical reads的选项--skip-technical。但我谷歌了一大圈，并没有找到官方的说明，有人甚至认为这可能是作者上传 ENA 时的失误……

其实要验证这一点，我们可以比较一下从 ENA 下载的.fastq文件和fastq-dump输出的结果：

分别展示前 4 行

head -n 4 SRR10211573_2.fastq

@SRR10211573.1 K00384:78:HLM37BBXX:3:1101:27630:1261 length=98
CATTTTGTANTACGGGGATACCTGNGACTGCACCNTTAAAAAATATATTTATCATTTAANTCTTGGGTAANCACACTTCATAACAGAGNAGAGNGANT
+SRR10211573.1 K00384:78:HLM37BBXX:3:1101:27630:1261 length=98
A<<-----<#--7--7---77A-7#7JJFAAJ7J#7-FF-<--<--77--77AF<----#-<<----<77#FJ-<-AJ--7--7-7--#-7-<#--#-

head -n 4 SRR10211573.fastq

@SRR10211573.1 K00384:78:HLM37BBXX:3:1101:27630:1261/2
CATTTTGTANTACGGGGATACCTGNGACTGCACCNTTAAAAAATATATTTATCATTTAANTCTTGGGTAANCACACTTCATAACAGAGNAGAGNGANT
+
A<<-----<#--7--7---77A-7#7JJFAAJ7J#7-FF-<--<--77--77AF<----#-<<----<77#FJ-<-AJ--7--7-7--#-7-<#--#-

碱基序列部分是完全一样的。