【转录组-1】RNAseq基本知识

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概念

广义:转录组(transcriptome)是特定细胞在某一功能状态下转录本的总和。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基因表达情况是不完全相同的,具有特定的空间性和时间性。

狭义:转录组是指直接参与蛋白质的mRNA的总和

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各种RNA的功能

mRNA:编码基因
tRNA:携带氨基酸到核糖体上进行蛋白质的合成
rRNA:与多种蛋白质结合成核糖体,作为蛋白质生物“合成”的装配机

micro RNA/mi RNA :调控基因表达
snoRNA(核仁小RNA):参与rRNA成熟加工
snRNA(核内小分子RNA):参与mRNA的剪接
gRNA(引导RNA):参与RNA编辑
SRP-RNA(信号识别颗粒)参与蛋白质分泌
dsRNA(双链RNA):基因沉默
IncRNA长链非编码RNA:表达调控
······


RNA-seq分类

  • 1.测序物种:原核转录组和真核转录组 还有宏转录组

  • 2.建库测序类型:常规转录组和 链特异性转录组(可以识别来自那一条链)

  • 3.有无参考序列: 有参考序列的RNAseq和无参考序列的denovo RNA-seq

  • 4测序目标:IncRNA、sRNA等


RNA与DNA测序之间的差异

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转录组测序技术的发展

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分子杂交:RT-PCR(Real Timeq PCR)通过对经典PCR扩增反应中的每个循环产物荧光信号的实时检测,我们可以实现对模板的定量分析,通过正确设定引物(primer)和探针(probe),qRT-PCR技术可以很大范围内定量检测目标转录本的拷贝数,即表达水平。

EST(Expressed sequence tags):表达序列标签。是指从不同组织来源的cDNA序列,通过对一个随机选择的cDNA克隆进行单次测序来获得cDNA的部分序列,只要测序到一个基因的EST片段,就能证明这个基因是有表达的。EST是基于测序的,并不需要事先知道待检测转录本的序列。

基因表达的连续分析技术(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)能同时对上千个转录本进行研究。
SAGE技术的主要依据有两个:
(1)一个9~10碱基的短核苷酸序列标签包含足够的信息,足以特异性的确定某一种转录本。
(2)如果将短片段标签相互连接,集中形成长的DNA分子,则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签,并能以连续的数据形式输入计算机中进行处理,这样就可以对数以千计的mRNA转录本进行分析,这个和DGE技术有些类似。

基因芯片(genechip)也叫微阵列( microarray)通过将几十万个不等的探针(probe)分子固定在约1厘米见方的固体片基上制成。利用核苷酸分子在形成双链时碱基互补配对的原理,微阵列可以一次性检测出样本中所有与探针互补的核苷酸片段,从而快速得到样本中基因的表达谱(expression profile)
缺陷:只能检测已知物种的转录表达情况,无法检测芯片中不包含的序列,并且不容易定量。

数字基因表达谱DGE(Digital Gene Expression Profiling)DGE利用新一代高通量测序技术和高性能计算分析技术,能够全面、经济、快速的检测到某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况。
缺陷: 基于序列标签进行测序,只能适用于真核生物,不适合原核生物。

以上技术缺陷:
第一: 需要依赖已知参考序列,如果没有一直序列,就无法捕获。
第二:通量低,一次不能捕获全部的转录情况
第三:只能定性,不能定量,只能确定有无,不能确定多少。只能确定一个基因是否表达,不能确定表达量的多少。
第四: 不适合所有物种


RNA-seq与基因芯片的比较

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RNA-seq技术优势

  • 1RNAseq直接得到核酸序列信息,除了可以得到基因表达量的差异,更可以检测RNA结构和结构变异。

  • 2 开放性的转录组分析:无需参考基因组信息,无需设计探针,不但能检测已知基因还能发现新的转录本。

  • 3 在测序覆盖度足够大时能够检测细胞中的低丰度转录本。

  • 4 随着测序深度的增加,可以获得更广的动态检测范围,能够同时鉴定和定量高丰度和低丰度转录本,定性和定量都更加准确。

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