GATK4.1 call SNP

GATK4.0 和之前的版本相比还是有较大的不同,更加趋于流程化。

软件安装

1 wget https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.1.5.0/gatk-4.1.5.0.zip 
2 unzip gatk-4.1.5.0.zip
#该安装步骤仅供参考,需要加入环境变量才可以直接调用

下载GATK

wget https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.1.9.0/gatk-4.1.9.0.zip
unzip gatk-4.1.9.0.zip
#进入环境变量修改PATH,很重要
sudo vi /etc/profile
#添加下面的PATH
# export PATH=$PATH:/home/zhiwufy/biosoft/gatk-4.1.9.0
source /etc/profile

下载后解压

image
# 在该目录下
conda env create -n gatk -f gatkcondaenv.yml -y
# 本次安装 -y参数 出错,原因未知 去掉 -y

检查是否成功

python -c "import vqsr_cnn"
# 出现:Using TensorFlow backend,则成功
# 出现:ImportError: No module named vqsr_cnn,则失败

#报错:ModuleNotFoundError: No module named 'numpy.testing.decorators'
#原因 numpy 版本不匹配!
pip uninstall numpy
pip install numpy==1.18 # > 1.18
pip install scipy==1.1.0
python -c "import vqsr_cnn"
#通过验证

如果以后要更新gatk

需要先卸载掉原来的小环境,再重新安装,否则会产生报错,比如:

CondaValueError: prefix already exists: /anaconda2/envs/gatk

安装的正确方法:

source deactivate
conda env remove -n gatk
# 然后重新运行上面的安装代码

另外gatk运行还需要依赖Java

先进入到gatk小环境,再安装openjdk即可

apt-cache search openjdk
conda install -c conda-forge openjdk
sudo apt-get install openjdk-8-jdk

GATK 简单说明

## 帮助信息
gat --help

## 列出所有的工具
gatk --list

## 工具的说明,比如以VariantAnnotator 为例
gatk VariantAnnotator --help

GATK分析简要流程

  • 所需数据 : ref.fa

      • reads1.fq
      • reads2.fq
  • 建立索引(本人使用的是hisat2,结果差异不大)

bwa index ref.fa
samtools  faidx ref.fa
gatk CreateSequenceDictionary -R ref.fa -O ref.dict
gatk CreateSequenceDictionary  -R Tifrunner2.fasta  
##
-R Input reference fasta or fasta.gz  Required
-O  输出文件
  • 比对

## bwa 比对
bwa mem -t 4 -R '@RG\tID:id1\tPL:illumina\tSM:test' ref.fa test_1.fq test_2.fq | samtools view -bS - >test.bam

##参数
-R 设置reads group,gatk必须要的信息,其中ID,PL和SM信息是必须要的

## 排序
samtools sort -@ 3 -o test.sorted.bam test.bam
rm test.bam

GATK 要求read group的格式

ID = Read group identifier

每一个read group 独有的ID,每一对reads 均有一个独特的ID,可以自定义命名;

PL = Platform

测序平台;ILLUMINA, SOLID, LS454, HELICOS and PACBIO,不区分大小写;

SM = sample

reads属于的样品名;SM要设定正确,因为GATK产生的VCF文件也使用这个名字;

LB = DNA preparation library identifier

对一个read group的reads进行重复序列标记时,需要使用LB来区分reads来自那条lane;有时候,同一个库可能在不同的lane上完成测序;为了加以区分,
  同一个或不同库只要是在不同的lane产生的reads都要单独给一个ID. 一般无特殊说明,成对儿read属于同一库,可自定义,比如:library1

若是忘记添加read group信息还以通过 AddOrReplaceReadGroups 添加

gatk AddOrReplaceReadGroups -I .bam -O .add.bam -LB library1 -PL illumina -PU pl1 -SM name

##参数
-I Input file (BAM or SAM or a GA4GH url);
-O  Output file (BAM or SAM);
-LB Read-Group library;
-PL  Read-Group platform (e.g. ILLUMINA, SOLID);
-PU Read-Group platform unit (eg. run barcode);
-SM Read-Group sample name 

## 建立索引

samtools index test.sorted.markup.bam
  • 标记重复序列

gatk  MarkDuplicates -I test.sorted.bam -O test.sorted.markdup.bam -M test.sorted.markdup_metrics.txt3 ##参数
-I 排序后的一个或者多个bam或者sam文件
-M 输出重复矩阵
-O 输出文件
 
# 建立索引
samtools index test.sorted.markup.bam

  • 检测变异

 ##两种方法

##(1)多样本一起call,此次只有一个样本,若有多个样本,则继续用 -I 参数添加即可
gatk --java-options -Xmx4G HaplotypeCaller -I test.sorted.markup.bam -O test.gvcf1 -R ref.fa

## (2)单个样本call,然后在合并
## 生成中间文件gvcf
gatk --java-options -Xmx4G HaplotypeCaller -I test.sorted.markup.bam -O test.gvcf -R ref.fa --emit-ref-confidence GVCF

##通过gvcf检测变异, -V 添加上步得到的gvcf
gatk GenotypeGVCFs -R ref.fa -V test.gvcf -O test.vcf

##参数
-I BAM/SAM/CRAM file
-O  输出文件
-R 参考基因组
--java-options: 若设置java则需要添加
-Xmx4G:内存为4G,防止内存太大
-V  A VCF file containing variants
  • 提取SNP,INDEL

## 提取SNP
gatk SelectVariants -V test.vcf -O test.snp.vcf --select-type-to-include SNP

## 提取INDEL
gatk SelectVariants -V test.vcf -O test.indel.vcf --select-type-to-include INDEL

##参数
-O 输出vcf文件
-V 输入vcf文件
--select-type-to-include 选择提取的变异类型{NO_VARIATION, SNP, MNP, INDEL,
                              SYMBOLIC, MIXED}
  • 对vcf文件进行过滤

gatk VariantFiltration -O test.snp.fil.vcf.temp -V test.snp.vcf --filter-expression 'QUAL < 30.0 || QD < 2.0 || FS > 60.0 ||  SOR > 4.0' \
    --filter-name lowQualFilter --cluster-window-size 10  --cluster-size 3 --missing-values-evaluate-as-failing

## 参数
-O 输出filt.vcf文件
-V 输入vcf文件
--filter-expression 过滤条件, VCF INFO 信息
--cluster-window-size 以10个碱基为一个窗口
--cluster-size 10个碱基为窗口,若存在3以上个则过滤
--filter-name 被过滤掉的SNP不会删除,而是给一个标签, 比如 Filter
--missing-values-evaluate-as-failing 当筛选标准比较多的时候,可能有一些位点没有筛选条件当中的一条或几条,例如下面的这个表达式;QUAL < 30.0 || QD < 2.0 || FS > 60.0 || MQ < 40.0 || HaplotypeScore > 13.0 并不一定所有位点都有这些信息,这种情况下GATK运行的时候会报很多WARNING信息,用这个参数可以把这些缺少某些FLAG的位点也给标记成没有通过筛选的。
  • 筛选PASS的SNP,INDEL

## 根据FILTER那列信息进行筛选
grep PASS test.snp.fil.vcf.temp >  test.snp.fil.vcf

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