重组Recombination----猪病“小兰”的时空之旅【连载-11】

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Tips:

病毒重组是PRRSV病毒变异的最大动力

重组毒是筛选后有一技之长的幸存者

减少农场中的毒株种类是减少重组,稳定PRRS状态的重要法则

今天登陆公众号编辑页面的时候突然看到网站变成全英文界面了,腾讯你是闹哪样?看样子心不小啊,自打撺掇着老外用wechat以来,现在要捣鼓老外当网红了--国际化又往前走了一点点。突然“尬悟”出一个道理,“变”才是生存之道,“变”才是适应之法。小兰自古无常性,变化多端、琢磨不透,练的都是迷“踪”拳。话说固定靶易瞄,活动靶难打,基因变异和其导致的毒株多样性是PRRSV难防的重要原因,而变异当中,核苷酸(氨基酸)替换都是小打小闹,缺失和重组才是大事件。今天我们来扒一扒小兰的重组。

【重组机制】

从PRRSV的复制周期来看,大致分为吸附,侵染(脱衣壳),翻译表达病毒复制相关蛋白,翻译表达亚基因组和结构蛋白,合成子代基因组RNA,包装病毒粒子和从细胞内滚蛋到细胞外。重组是当两种(或者有可能两个以上)毒株共感染一个细胞的时候,基因组复制过程中,复制酶从A毒株基因组RNA滑落,重新搭上B毒株RNA的过程,搭错模板后用新的模板继续延伸RNA合成,导致两个毒株来源的RNA组合到一个基因组中,然后被包裹成子代病毒。

Ref:Matthew A.KappesandKay S.Faaberg,2015

病毒是有准种的,往往重组出各种千奇百怪的子代病毒(个体),但并不是所有的子代病毒都能存活或者繁衍下去,还要经过很多轮宿主严格的筛选下,弄不死的,或者复制能力更强的才能优选出来。比如重组出来的病毒移码突变了,产生终止密码子了,病毒自己就残了,都不用宿主系统弄它;其次是有可能产生的子代病毒,吸附不行,复制不行,拮抗病毒抗病毒分子的能力不行,或者容易被宿主免疫系统识别的都被干掉了。这样剩下的必是“毒中精华”,要么能有很猛的复制能力,要么能够escape宿主的限制。其实这个残酷的筛选过程,就像把初生的西藏土狗放到一个坑里进行自然生存筛选,最后剩下的那条才叫“獒”。

【人工重组】

病毒重组研究可能最开始只是观察到重组毒株的存在,但真正证实这个理论的是我们业界大牛袁世山老师,传说当年他在学术界的时候爱好是抽烟、喝酒、看paper,后来进军工业界,JVI又因此损失不少版面费。当年在明尼苏达大学的时候他用两种毒株共感染MA-104细胞(MARC-145的上一辈),然后分离纯化子代病毒,进行序列测定和分析发现6个独立的重组事件,并且发现了ORF3和ORF4发生嵌合的病毒。同时还证实美洲型和欧洲型之间由于亲缘关系太远,没法发生重组,目前除了用反向遗传学的方法人工构建局部基因(比如E)替换的嵌合病毒,还没有两基因型毒株间自然重组的报道。

除了细胞水平的体外重组实验,Boss Yang 实验室后来还做了毒株间体内(in vivo)重组的实验,我们当时使用JXwn06-81c(HP-PRRSV传代致弱毒)和HB-1/3.9c两个低致病性毒株共感染5头6周龄的SPF仔猪,然后噬斑纯化分离不同时间血清中的病毒,然后进行序列测定和比对、SimPlot和GARD重组分析。结果发现,从感染后3 d就开始有重组病毒出现,5头猪中有4头分离到重组病毒,具体重组模式和重组事件可能大家并不太关心,但真正有料的是,在重组的病毒当中,各种毒株比例是不相同的,我们选取了6种优势重组毒,进行PAM细胞中的感染增殖,测定增殖动态后,最后选了两株长势最猛的进行攻毒实验,并与两个亲本毒做比较,最后发现重组毒攻毒组猪只的体温反应、临床症状和病理损伤都高于亲本,关键还出现了死亡率。这就是病毒界的“杂交优势”(便于理解但不够确切的伪科学定义),一个残疾病毒互帮互助,发生逆袭的励志故事,让两个臭皮匠就抵了个诸葛亮。这个故事也是第一次在芝加哥国际PRRS大会上用英语做的报告,所以记忆犹新。

【DNA shuffling】

DNA Shuffling 是一个把人工重组玩到极致的打法。具体Shuffling很难有比较合适的翻译,但意思是砌长城的时候洗牌之后重新码牌,这个中国人应该都明白了。这个技术是把不同来源的亲本DNA片段用核酸酶“打散”之后,重新再组成马赛克嵌合(chimeric)基因。这个技术被用于酶活性提升,病毒嗜性改变,中和活性增加等。这个方法比传统杂交技术,有多亲本,速度快,易重组(PCR管理搞定)的优势,配合上方向遗传学病毒拯救技术,就可以把多个病毒来源的基因拿来搓散了再揉回去(一听就很过瘾)。在美国的时候就是用这个方法来构建不同谱系(lineage)的“杂交病毒”,以期筛选到具有广谱中和能力提高的nextgeneration 疫苗候选株。但理想的性感和现实的骨感共存,杂交病毒易构,生物性状难筛。此外,如果靶标基因同源性过高的情况下,这个方法会经常筛不出突变。

【临床重组毒株叠现】

以前可能养殖规模没那么大,生猪和产品流动没那么频繁,各类毒株各占山头,碰面机会不多,因此重组毒株的发现和报道并不太多。但随着养殖规模的扩大,各种引种,动物迁移流动,加之2006年HP-PRRSV暴发之后各种活疫苗的广泛使用,使生态中的病毒总量增加不少,各类毒株在同一个猪场出现循环,发生重组成为大概率事件。MangShi曾经用“大数据”方法把GenBank发表序列进行分析,发现2006高热暴发之后在2009-2010年间再掀感染流行高潮就是源于一次HP-PRRSV毒株间的重组事件。

这个是从病毒群体的角度来全面分析,如果从单个毒株的重组分析来看,这样的例子更是不胜枚举。特别是NADC30-like毒株传入我国后,易与国内毒株重组是其重要特点,它的混乱事迹更是不绝于耳。哈兽研安同庆老师和Mang Shi 最早在JVI上发表的文章表明,NADC30的传入以及与HP-PRRSV的重组是导致2013-2014年间大量暴发的重要原因。

我们也发现一株HP-PRRSV疫苗株与NADC30-like重组的病毒TJnh1501,经致病性分析发现它的致病性显著高于量亲本毒株,说明重组使其致病性增加,但还是低于HP-PRRSV。其实这样的重组事件报道还很多,就不一一赘述了。

【防控意义与用苗禁忌】

考虑到毒株重组往往导致病毒致病性有1+1>2的效应,加上重组毒株经宿主一筛选往往留下来开始扩繁开的都是能够更好逃逸免疫系统的突变株,因此重组毒的出现往往会导致猪场PRRS稳态的打破,诱发新的疫情。所以在PRRS防控过程中有几个要点需要注意(敲黑板):

尽量减少引种来源,做好隔离监测。

有条件的引入阴性种猪,在本场进行驯化转阳。

使用单一毒株来源的PRRS活疫苗,不混用或频繁更换疫苗毒株。

做好场内外生物安全管控,避免新毒株的引入,减少场内病毒载量,减少重组概率。

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