如何快速了解新接触的质粒(一)

    质粒(plasmids)是常用的一种载体(Vecto),是做分子相关领域永远无法躲避的一道难题,不管做分子克隆,蛋白表达,包装病毒等等都需要用到质粒,所以当你开始一项课题或者实验的时候,第一步必然是深入了解自己所需要的质粒以及它的图谱结构。接下来我会对质粒的各个要素进行持续的讲解,如有遗漏,欢迎补充。

01

质粒的基本概念和分类

    质粒是生物细胞内固有的,能独立于寄主染色体自主复制,并稳定遗传的一类核酸分子。质粒常存在于原核细菌和真菌中,绝大多数为双链DNA(多数环状,现在也发现了有线性的),少数为RNA型。

质粒的分类

1. 按照质粒在寄主细胞中的复制能力,分为严紧型质粒和松弛型质粒。

严紧型质粒:当细菌染色体复制一次,质粒也复制一次,每个细菌内包含1~2个质粒,所以严紧型质粒在扩增的时候得到的产量比较少,那你所得到的质粒浓度也会比较低,当你纠结为什么质粒浓度上不去的时候,不妨考虑一下是不是严紧型质粒导致的。低拷贝的质粒往往应用少,但是存在即合理,有些地方还是用的到的。一般分子量大的属于严紧型质粒。

松弛型质粒:当细菌染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细菌内含有20个左右的质粒,这些质粒的复制在寄主细胞的松弛控制下,每一个都能大量的复制,采取一定条件抑制蛋白质合成能增加质粒的扩增。松弛型质粒所得到的质粒含量和浓度就非常的大,能够满足正常实验的需求。

2. 按照质粒载体功能

克隆质粒载体:一般是高拷贝的就是上面讲的松弛型质粒,将需要的目的基因插入到质粒后倒入到细菌中,进行大量克隆扩增目的片段。

表达质粒载体:是指在克隆载体基本骨架上,加入一些表达元件等,使得插入的外源DNA(目的基因)在宿主细胞中复制,转录和翻译。

3. 按照进入受体细胞的类型

真核质粒

原核质粒

穿梭质粒是指能在两种宿主细胞内复制的质粒,只要是具有真核和原核两种不同的复制子。如下图pCMV6质粒所示,有ori和SV40ori两个启动子,很有可能就是穿梭质粒。

4 还有一些其他分类方法在这里就不阐述了。下面是简单分类的脑图,帮助快速查看。

02

质粒的特征

    质粒有两个比较有意思的特征,帮助我们加深对质粒的认识和理解。不知道你有没有想过一个细菌中能否存在别的质粒?质粒既然是环状DNA小分子,那它能不能在细菌之间进行转移?这就涉及到质粒的两个有趣特征。

 1. 质粒的不相容性

    同种或者亲缘关系比较近(比如利用同一复制系统)的两种质粒是不能稳定的存在一个细胞内。当一种新的质粒进入到含有质粒的细菌中时,若两种质粒同源或者近缘,他们会相互竞争资源,优胜劣汰。

2. 质粒转移性

    质粒在自然条件下,可以通过特定移动基因的作用转移到新的寄主细菌中。目前实验室中的质粒基本上都含有筛选的抗性基因,有强大的抗抗生素能力,但是它缺少移动作用的基因,可以保证质粒不会扩散污染环境。最重要的一点:做完实验后,所有质粒实验相关的耗材,试剂,菌种,残留培养基都要进行灭菌处理!!这是作为一个科研人的基本素质,不能因为偷懒酿而成大错。

这期主要讲了拿到一个质粒之后,你要根据自己的目的来判断它是否符合自己的基本要求。比如需要松弛型还是严紧型,是需要克隆质粒还是需要表达质粒,是需要穿梭质粒还是仅仅原核/真核。这是学会查看图谱之前最基础的一部分,有的时候会起到意想不到的效果。

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