临床激酶药物靶点一览(二)|编译

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现有药物的额外靶标

该研究发现,绝大多数化合物与蛋白激酶或脂质激酶结合,但也有结合其他靶标的,如另外七种代谢激酶,还发现了十九个与核苷酸结合的化合物、五个与FAD结合的化合物以及与血红素结合酶FECH结合的化合物。这些意外的相互作用可能导致预期的结果,也可能揭示药物毒性的机制。

一项对科学和专利文献(Pubmed, Scifinder, ChEMBL)的调查显示,在这项研究中考查的243种药物中,有许多药物在靶标空间或生物活性方面的特异性非常差。截止本文发表之前(2017年底),在PubMed中列出的文章超过11万篇,在SciFinder中有超过9万篇文章和4.7万多项专利,ChEMBL有超过2400项生物活性物。PubMed或SciFinder中超过50%的文章仅涉及了五种药物(雷帕霉素、伊马替尼、索拉非尼、吉非替尼和厄洛替尼)。采用结构检索方式发现所有化合物在Scifinder中都有对应的专利,17种药物完全没有进入PubMed (Scifinder文章有4种),35种药物在ChEMBL中没有列出生物活性,70种药物在PubMed中少于10篇文章(Scifinder中有50篇)。所有这些分子都已经在人类身上进行了测试,相关研究却如此不足值得关注。

因此,本研究报道了大量以前没有科学文献报道过的新型分子的相互作用和脱靶现象,如达巴非尼,据报道是BRAF的选择性抑制剂。但Kinobeads数据表明,该药物是多激酶抑制剂,有大概30个亚微摩尔级别的靶点。

我们的结果也证实了最近批准的BCR-ABL抑制剂Ponatinib的结合实验数据。其更有效的靶标是ZAK和MAPK14 (p38α)。这两种蛋白都是MAPK通路的关键调控因子,抑制MAPK通路与预期和非预期效应有关。值得注意的是,有16个针对ZAK、15个针对p38α的抑制剂,其中有十个药物同时针对这两个靶标。不过,同一基本通路的两个节点受到抑制可能导致多效性和不可预测的生物学效应。

显然,多重药理学也提供了治疗机会,我们的交互筛选为临床重新评估或作为开发新化合物的化学起点提供了许多选择。以往激酶药物的早期发现集中在很少的激酶上,但近年来更多的激酶受到了关注。

如SIK2,炎症和自身免疫领域的靶标,抑制SIK2的达沙替尼或SIK工具化合物HG-9-91-01已经被证明可以减少BMDM细胞促炎细胞因子如TNFα的产生,并上调抗炎蛋白IL- 10的分泌。Kinobeads实验确定了21个SIK2抑制剂的亲和力比已知的AZD-7762,BMS-690514以及Crenolanib, PF-03814736还要好,低于500 nM。

另一个新兴的靶点是NTRK1 (TrkA),因为NTRK1融合蛋白已被确定为肺癌、结肠癌和脑癌的致癌驱动因子。我们的分析确定了20种NTRK1抑制剂,并对KM12结直肠癌细胞(由TPM3-NTRK1驱动)的活力进行了检测,结果显示,XL-228、Foretinib、Lestaurtinib和TAK-901等与已知的NTRK1抑制剂恩特列替尼具有相似的作用。

全面的靶标分析还可以提高对KI的MoA的理解。一个例子是正在进行骨癌临床试验的双SRC/ABL抑制剂Saracatinib。本实验通过对骨形态发生相关蛋白,如BMPR1A、ACVR1和ACVR1B等的分析发现,它们都是与药物亲和力极高的靶点。骨肉瘤细胞系U-2 OS (BMPR1A高表达)对Saracatinib的敏感性高于非相关卵巢癌细胞系NCI/ADR-RES (BMPR1A低表达)。两种细胞系的mRNA沉默实验表明,药物敏感性并不完全由SRC表达引起,至少部分效应确实是通过抑制BMP受体信号传导介导的。进一步的WB分析显示SMAD1/5/9磷酸化(下游BMP效应蛋白)和SRC自磷酸化水平呈剂量依赖性下降。这一数据表明,SRC和BMP受体对于细胞活性都起到重要作用,Saracatinib在骨肉瘤细胞中通过双重模式起作用。

鉴于上述情况,我们再次强调,了解一种药物的全部靶谱是重要的,我们的资源填补了科学文献中的一个重要空白。此外,对药物靶点相互作用的系统识别可能成为临床医生的一个有价值的工具。特别是,对于医生和科学家整合临床和分子数据,以确定针对患者的最佳治疗方案有很高价值。

临床激酶抑制剂的传统靶点更少

由于Kinobeads上固定的化合物是ATP类似物,已经证明其他核苷酸结合蛋白也可能与之特异性结合。

这里报告的大量数据对先前的观察进行了扩充。例如,代谢激酶PDXK已经被证明通过吡啶嘧啶结合位点与Seliciclib (Roscovitine)结合。我们检测到PDXK与PLK1抑制剂BI-2536的表观结合常数为387 nM,可能通过直接与PDXK的ATP位点结合。有几个KI可以有效地结合CoA脱氢酶ACAD10 (如Alisertib) 和ACAD11 (如Crizotinib),一种合理的解释是它们可能与酶的FAD位点结合。

同一酶超家族的另一个成员NQO2,该酶被BCR-ABL抑制剂伊马替尼有效抑制。我们的数据又发现了9个亚微摩尔级别的结合物,最显著的是Pacritinib (Kdapp= 4 nM)和Crenolanib (Kdapp=40 nM)。先前的X射线晶体学研究表明,伊马替尼与酶的FAD结合位点结合。利用X射线晶体学研究Crenolanib (PDB code 5LBY)、Volitinib (PDB code 5LBW)和Pacritinib (PDB code 5LBZ)的结合模式,结构表明所有化合物通过π-stacking作用与FAD的异咯嗪环结合。因此,NQO2是一种比先前预期更为常见的KIs脱靶靶标,但这种相互作用的生理/病理相关性仍不清楚。

最近的报道表明,激酶抑制剂可以结合铁螯合酶(FECH),FECH抑制是Vemurafenib患者临床观察光敏性的原因。激酶抑制剂可以结合原卟啉结合位点。目前对243种临床药物的分析确定了另外4种FECH结合剂,使其总数增加到30种,这进一步支持了FECH检测应该成为临床前KI检测的一部分的观点。

一些激酶形成相对稳定的蛋白质复合物。在网格蛋白介导的内吞作用中起作用的AP2复合物的成员最为常见(AAK1, AP2B1, AP2S1, AP2M1)。其他包括炎症反应调节复合物(TBK1,TBKBP1, AZI2, TANK), tRNA修饰KEOPS复合物(TP53K, TPRKB, OSGEP, LAGE2),其他与激酶相互的,如支架蛋白(INPPL1,INCENP)和信号分子(CSNK2A1/2和EIF3J(40);LATS1MOB1)。 CDK-cyclin复合物是一个有趣的例子。根据功能不同,CDKs可分为几个细胞型MoAs,调控(CDK1/2/4/5/6/7)、转录(CDK7/9/11/12)或其他(CDK16/17/18)。CATDS分数显示大部分已知的CDK抑制剂特异性都不好。相反,几个脱靶抑制CDKs的化合物显示出更好的特异性。这意味着在未来设计CDK抑制剂可以参考这些抑制剂。

从靶标到信号通路

将现有化学蛋白组学数据和Proteomics DB整合,并添加显示每个KI的靶标谱和剂量响应功能,这一独特的在线资源还可以探索潜在的药物组合,如克服耐药性。例如,有研究表明,肿瘤微环境分泌的生长因子会导致FGFR介导的信号转导,绕过Gefitinib抑制的EGFR信号通路。ProteomicsDB可以同时显示多个靶蛋白及其各自的抑制剂,以及这些化合物靶向的其他蛋白。基于这一想法,我们选择了FGFR1抑制剂AZD-4547与Gefitinib联合作用于四种细胞株:A-431,EGFR-WT,皮肤,EGFR-WT ACHN、肾,IGROV-1,EGFR-WT,卵巢,PC-9, 肺, EGFR激活E746-A750缺失。有趣的是,无论EGFR是否携带激活突变,联合用药在抑制细胞活力和增殖方面总是比单独用药更有效。

药物发现的一个关键挑战是评估药物分子是否与细胞中的靶标或相关通路相结合。现有资源允许我们通过分析肿瘤细胞对KI治疗反应的磷酸化蛋白组,并将这些信息与所使用药物的靶标谱相结合,来探索这一问题。为了阐明这一概念,我们使用EGFR/HER2抑制剂Lapatinib、Afatinib、Canertinib、Dacomitinib和Sapitinib处理BT-474细胞并测定了的磷酸化蛋白,其磷酸化位点深度在1.5万个左右。

分析结果显示,每种药物都有大量具有统计学意义的磷酸化调控事件。五种药物对BT-474细胞的选择性不同(CATDS分别为1.00、0.78、0.94、0.77、0.73);形成了一个主要靶标EGFR/HER2的共同网络。211个合成的蛋白(274个受调控的磷酸化位点,其中至少有4个来自5个抑制剂)中,许多被映射到该网络,并可进行功能解释。例如,从ERBB2中减少pY1248上的自磷酸化表明药物是“目标药物”。KRT8磷酸化减少(EGFR的底物)可作为降低EGFR活性的靶-近端读出。MAPK1和MAPK3磷酸化水平的降低(ERK1/2)证实了MAPK信号通路在药物作用下的参与角色。有趣的是,所有五种药物都导致CHEK1的激活(通过减少AKT下游抑制位点pS280的磷酸化),从而表明DNA损伤反应通路的激活和对凋亡的保护。

这样的观察不仅揭示了药物如何在细胞中发挥作用,而且还可以使联合用药合理化,例如使用高选择性CHEK1抑制剂Rabusertib。有许多蛋白的磷酸化发生了显著变化,但与EGFR/HER2通路没有明显的联系(如转录因子FOXK1和2),其中有几个位点或蛋白的功能很少或没有归属功能。然而,这些蛋白在细胞中对EGFR抑制剂始终表现出强烈的反应,这一事实可能意味着这些蛋白确实是该网络的成员,并可能作为药物作用的反应标记。

为了评估多重药理学的分子水平结果,比较不同药物的磷酸化特征也很有价值。例如,RIPK2最近被认为是乳腺癌的靶点。除了EGFR,,Kinobeads谱分析显示,Canertinib和Sapitinib是RIPK2的有效抑制剂,而Lapatinib、Afatinib和Dacomitinib则不是。因此,在BT-474细胞中,RIPK2 pS363的水平仅被Canertinib和Sapitinib降低。因此,这个位点是针对RIPK2而非EGFR的药物的靶点参与标记。同样,上述分析清楚地表明,为了了解任何激酶抑制剂的细胞MoA,有必要对其靶空间进行彻底的分析。

To be continued…

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