成骨细胞中lnc-ob1通过上调Osterix基因促进骨的形成

​文献简介

文章标题

成骨细胞中lnc-ob1通过上调Osterix基因促进骨的形成

发表期刊

《自然-新陈代谢》

发表时间

2019年

No.1

前言

1.lncRNA属于一类不具有编码能力的主要RNA,其长度大于200个核苷酸。在过去几年中受到了相当大的关注,lncRNA广泛的参与了细胞周期调控、细胞凋亡和分化以及表观遗传等生物学过程。

2.越来越多的高通量测序研究结果表明,lncRNAs参与了体内分泌的生理和病理生理学过程,包括内分泌,生殖,代谢,神经,免疫和心血管系统。

3.近年来,lncRNAs在体外被证明参与了成骨细胞的成熟和前体间充质干细胞的成骨分化过程,然而,在体内,IncRNA是否能够影响骨代谢,调节骨形成还不清楚。在众多的候选IncRNA中能否发现在体内促进成骨的保守性lncRNA分子,进而能否将lncRNA作为骨质疏松症干预的潜在靶点,是本领域亟待解决的重要问题。

本文就lncRNA对骨形成的调节展开了研究,最终找到了lnc-ob1促进骨形成的分子机制,为人的骨质疏松症治疗找到了潜在的药物治疗靶点。

No.2

方法及结果

本研究首先以人鼠骨髓干细胞进行成骨细胞诱导分化,然后对干细胞及诱导分化细胞进行转录组分析(a),以解析分化过程中差异表达的lncRNA,分析结果如下图:

总共鉴定2028个lncRNAs在人成骨细胞分化过程中差异表达;1436个lncRNAs在鼠成骨细胞分化过程中差异表达(b)。作者通过保守序列分析与基因组定位发现人和鼠5个共同上调的lncRNA,有趣的是,仅lnc-ob1在骨中有较高表达,且在成骨细胞中表达高于破骨细胞和干细胞(c)。作者又对骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞以及脂肪干细胞进行成骨细胞细胞诱导分化,以检测lnc-ob1的表达情况,结果发现lnc-ob1在干细胞成骨分化过程中表达量不断提升(d,e),同时,作者又检测了lnc-ob1在骨质疏松人和小鼠成骨细胞中的表达情况,发现骨质疏松患者成骨细胞中lnc-ob1显著下调(f),这表明lnc-ob1对骨质疏松存在某种调节作用。

      在lncRNA的研究中,一般认为lncRNA的作用靶点为其邻近基因,因此作者通过基因组浏览器找到其邻近基因,并以成骨细胞中过表达或干扰lncRNA来检测其邻近基因表达是否受影响,结果表明lncRNA不影响其邻近基因表达。

紧接着,作者探索了lnc-ob1在机体内对骨的影响,作者通过在小鼠成骨细胞特异性敲入lnc-ob1以检测其骨的变化,其主要的检测方法为骨的形态计量学与组织学分析方法,结果表明,在小鼠的成骨细胞特异性敲入lnc-ob1可增加小鼠骨的含量。

为验证lnc-ob1是影响骨量变化的单一因素,作者又通过对成骨细胞特异性敲入lnc-ob1连续四周静脉给药ASO(一种囊泡包裹的纳米颗粒,可将特定siRNA运送到特定受体细胞释放),通过该方法,作者干扰了小鼠成骨细胞中的lnc-ob1的表达,作者发现,当lnc-ob1被干扰表达后,能显著抑制KI小鼠的过度骨形成。

这说明了lnc-ob1在机体内可影响骨的形成。同时,作者对子宫切除小鼠(OVX)进行成骨细胞靶向给药lnc-ob1,观察小鼠骨含量的变化,作者发现成骨细胞靶向给药lnc-ob1可逆转OVX小鼠骨丢失。这说明lnc-ob1可作为骨质疏松治疗的潜在靶点。

紧接着,作者对lnc-ob1影响骨形成的分子机制展开了研究,首先作者在体外对分离出的成果细胞中的lnc-RNA进行过表达和干扰其表达,再研究其分化标记基因的表达以及矿化程度检测,作者发现,lnc-ob1/lnc-OB1促进成骨细胞分化。

同时,作者又对lnc-ob1影响成骨细胞分化的机制展开了研究,

作者通过成果细胞中lnc-ob1表达的干扰,以探究随着变化的基因,然后寻找lnc-ob1可能影响的基因,首先,作者对差异表达基因进行KEGG分析,结果表明差异基因与骨的形成分化等生物学过程相关,重要的是,在这些差异基因中,作者发现了一个被报道的成骨细胞特异性转录因子Osterix基因,作者通过在成果细胞中过表达或干扰lnc-ob1的表达,Osterix基因在mRNA和蛋白水平均会随之变化,且呈现一定的正相关,在KI或者OVX小鼠体内分离出的成骨细胞中的lnc-ob1与Osterix基因之间也存在正相关关系,这表明Osterix基因可能是lnc-ob1的作用靶点。

       接着,作者对lnc-ob1影响Osterix基因表达的分子机制进行了探究,首先,作者利用生物素下拉质谱技术、RNA结合蛋白免疫共沉淀技术进行lnc-ob1的互作蛋白分析

作者发现,lnc-ob1的互作蛋白为Suz12,Suz12是多梳抑制复合物2(PRC2)的蛋白成员,负责组蛋白H3(H3K27)上赖氨酸27的三甲基化,已有研究表明没有PRC2与组蛋白的结合组蛋白甲基化修饰将无法形成,因此,作者猜想,lnc-ob1可能是通过影响Suz12蛋白与PRC2的结合从而影响组蛋白修饰从而导致Osterix基因的表达,启动子区域的组蛋白甲基化修饰可干扰下游基因的表达。

因此,作者通过在成骨细胞中过表达或者干扰lnc-ob1的表达以研究Osterix基因启动子区域的组蛋白甲基化修饰水平,作者发现成骨细胞中lnc-ob1的表达与Osterix基因启动子区域的组蛋白甲基化修饰水平呈现出负相关

因此证实了lnc-ob1对Osterix基因的影响机制,Osterix(Osx)是迄今为止发现的唯一一个成骨细胞特异性转录因子,Osx只在骨组织细胞中表达,在干细胞向成骨细胞分化过程中起决定性作用,没有Osx就没有骨形成和骨再生。Osterix基因影响成骨细胞分化。

No.3

结论

本研究发现了一个成骨细胞特异性表达的长非编码RNA(lnc-Ob1)能够有效促进骨形成,实现成骨细胞靶向递送Inc-Ob1有效抵抗卵巢切除引起的小鼠骨质疏松。这些发现揭示了lncRNA在骨形成中的重要作用,提示骨组织特异性IncRNA可能作为一种潜在的骨质疏松疾病治疗新策略。

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