补体经典通路(classical pathway)溶血(hemolysis)活性的鉴定

Classical pathway haemolytic assays

Classical pathway

Protocol

  1. 将绵羊红细胞离心(100xg, 5min),使用DGVB2+ Buffer将洗绵羊红细胞三次。
  2. 使用DGVB2+ Buffer将绵羊红细胞重悬至109 cells/ml。
  3. 将重悬的绵羊红细胞以体积比1:1的方式与溶血素(1:3000稀释在DGVB2+ Buffer中)在37℃混合孵育20min(缓慢摇晃)。
  4. 使用DGVB2+ Buffer将绵羊红细胞洗两次。
  5. 使用DGVB2+ Buffer将绵羊红细胞重悬至8x107 cells/ml。
  6. 在绵羊红细胞中加入人类血清至0.125%人类血清浓度,在37℃混合孵育1h。
  7. 用分光光度法测定血红蛋白释放量(405 nm),此则为溶血量。

材料

  1. Veronal buffer(pH 7.3):
    0.15mM CaCl2
    141mM NaCl
    0.5mM MgCl2
    1.8mM Barbitone sodium
    3.1mM Barbituric acid

  2. DGVB2+ Buffer:
    2.5 mM Veronal buffer (pH 7.3)
    70 mM NaCl
    140 mM glucose
    0.1% gelatin
    1 mM MgCl2
    0.15 mM CaCl2

  3. 绵羊红细胞

  4. 溶血素

  5. 人类血清

参考资料

  1. Classical Pathway of Complement System
  2. Scabies Mite Inactivated Serine Protease Paralogs Inhibit the Human Complement System

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