前言
三代测序错误率比较高，一般组装后需要进行纠错来提高准确度。本次介绍使用Pilon通过引入二代测序数据来对三代基因组进行纠错。
Pilon官网
https://github.com/broadinstitute/pilon/wiki
Pilon软件安装
#conda 安装pilon
conda install -y pilon
#编译安装
wget https://github.com/broadinstitute/pilon/releases/download/v1.24/pilon-1.24.jar
chomd 755 pilon-1.24.jar
Pilon示例数据下载
#下载二代测序数据用于纠错
wget \
-O illumina.sra \
https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8482586/SRR8482586
本期需要纠错的基因组选择上期推文中Flye组装的nanopore数据进行演示，即下文assembly.fasta
Pilon示例数据处理
fastq-dump --split-files --gzip illumina.sra
fastq-dump会将sra格式转化成fastq格式，同时--gzip参数会对fastq进行压缩，示例illumina.sra最终会被转化为illumina_1.fastq.gz 和 illumina_2.fastq.gz
Pilon常用参数
--genome ： 设置需要纠错的基因组
--fix : 参数可选snps、indels、gaps、local、all等（默认all）
--changes ： 列出纠错位点
--frags ： 输入paired-end比对文件（不同测序数据该选项不同，具体查看该软件帮助文档；若不知道，可直接使用--bam
--output ： 输入结果前缀
--outdir ： 输出文件
--vcf : 生成vcf格式文件
Pilon使用案例
示例使用的是conda安装的Pilon
#对拼接结果建立索引（如何获得assembly.fasta详见Flye三代基因组推文）
bwa index assembly.fasta
#illumina与assembly.fasta进行比对，生成assembly_illumina.sam结果文件
bwa mem -t 12 assembly.fasta illumina_1.fastq.gz illumina_2.fastq.gz > assembly_illumina.sam
#将assembly_illumina.sam进行排序，生成assembly_illumina.sorted.bam
samtools sort -@ 12 -O bam -o assembly_illumina.sorted.bam assembly_illumina.sam
#运行Pilon
pilon --genome assembly.fasta --fix all --changes --frags assembly_illumina.sorted.bam --output pilon --outdir pilon_result --vcf
可能会遇到下面的报错信息，这是由于软件设定的内存不足造成的
Exception in thread "main" java.lang.OutOfMemoryError: Java heap space
at org.broadinstitute.pilon.BaseSum.<init>(BaseSum.scala:24)
at org.broadinstitute.pilon.PileUp.<init>(PileUp.scala:27)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion.$anonfun$new$1(PileUpRegion.scala:30)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion$$Lambda$52/0x0000000100178840.apply$mcVI$sp(Unknown Source)
at scala.collection.immutable.Range.foreach$mVc$sp(Range.scala:190)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion.<init>(PileUpRegion.scala:30)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeRegion.initializePileUps(GenomeRegion.scala:150)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$processRegions$4(GenomeFile.scala:104)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$processRegions$4$adapted(GenomeFile.scala:102)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile$$Lambda$51/0x0000000100169840.apply(Unknown Source)
at scala.collection.immutable.List.foreach(List.scala:333)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.processRegions(GenomeFile.scala:102)
at org.broadinstitute.pilon.Pilon$.main(Pilon.scala:111)
at org.broadinstitute.pilon.Pilon.main(Pilon.scala)
解决办法如下：
#查询pilon路径
which pilon
#修改pilon配置
vim /home/xiaoli/miniconda3/envs/NGS/bin/pilon
修改下图红色框，将 -Xmsg和-Xmx对应的数值调大，再次运行即可成功。
pilon debug.png
Pilon主要结果文件
pilon.changes #该文件列出了纠错的位点
pilon.fasta #最终纠错后文件
查看Pilon纠错效果
#有多少行代表有多少错误被纠正
wc -l pilon.changes
#统计纠错前后文件信息
seqkit stats pilon.fasta assembly.fasta
PS.纠错可以进行多次，即：将第一次纠错结果作为第二次需要纠错的文件再次纠错
