ELISA法鉴定补体(complement system)的激活

Complement activation assays

complement system

Protocol

  1. 96孔酶标板使用以下物质包被4℃过夜:
  • Classical pathway: 含2.5gµ/ml人免疫球蛋白(IgG)的Carbonate Buffer
  • Alternative pathway: 含20µg/ml酵母多糖(zymosan)的Carbonate Buffer
  • Lectin pathway: 含100µg/ml 甘露醣(mannan)的Carbonate Buffer
  1. 每个孔用200µl的blocking solution室温下封闭2h。
  2. 96孔酶标板使用以下物质孵育:
  • Classical pathway: 含3%人类血清的DGVB2+ Buffer室温下孵育20min(检测C4b和C3b)
  • Lectin pathway: 含3%人类血清的DGVB2+ Buffer室温下孵育45min(检测C1q和C9)
  • Alternative pathway: 含5%人类血清的Mg2+EGTA buffer室温下孵育35min(检测C3b)或者37℃孵育1h(检测C9)
  1. 使用适用于ELISA的C4b、C3b、C1q、C9室温下孵育1h。
  2. 使用含HRP的相应二抗室温下孵育30min。
  3. 使用1,2-phenylenediamine dihydrochloride检测490 nm处测定吸光度。

材料

  1. wash buffer:
    50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
    150 mM NaCl
    0.1% (v/v) Tween 20

  2. Carbonate Buffer:
    75 mM sodium carbonate

  3. blocking solution:
    1% (w/v) BSA in PBS

  4. DGVB2+ Buffer:
    2.5 mM Veronal buffer (pH 7.3)
    70 mM NaCl
    140 mM glucose
    0.1% gelatin
    1 mM MgCl2
    0.15 mM CaCl2

  5. 人类血清

  6. Mg2+EGTA buffer:
    2.5 mM Veronal buffer (pH 7.3)
    70 mM NaCl
    140 mM glucose
    0.1% gelatin
    7 mM MgCl2
    10 mM EGTA

参考资料

  1. Classical Pathway of Complement System
  2. Scabies Mite Inactivated Serine Protease Paralogs Inhibit the Human Complement System

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