思路为王-看大牛如何做大文章

一个明星想要爆红,需要团队来炒作。论文的发表其实也可以看成作者“炒作”的过程,有的人“炒作”自己的新颖的观点,有的人“炒作”自己的缜密的逻辑,有的人则是“炒作”一个概念,将这个概念辗转腾挪就会有新的发现,能够发多好的文章就要看故事怎么样了,也就是团队炒作的实力。

话不多说,今天这篇文章是最新发表在Nature上的一篇letter。

文章题目

文章的作者是一个大牛,名字叫做Axel Ullrich,大家注意这个人名字的发音,德国人的发音还是有所不同的。

作者介绍

看这个简介好像看不出来什么,他参与研发了靶向Her2的药物赫赛汀,开了五家公司,其中不乏被大公司收购,率先克隆出了EGFR,发现了PDGFR和VEGFR信号通路,2006年获得了华伦阿尔波特奖,这个奖主要奖励转化医学做出贡献的人,去年这个奖颁给了屠呦呦。

背景知识

1、FGFR4 基因在染色体的位置为5q35.1,长度为11.3kb,有18个外显子长度为71-600bp。本文中提到的非同义突变rs351855碱基转换的位置为1162位,为编码FGFR4蛋白第388个氨基酸密码子的第一个碱基,表现为C/T转换,密码子有GGG转化为AGG,在FGFR4蛋白合成过程中第388位氨基酸有甘氨酸(Gly)转变为精氨酸(Arg),其388位氨基酸位于RTK结构高度保守的跨膜区内。

图 1

2、文中涉及到的基因和蛋白。

(1)BiP/GRP78: endoplasmic reticulum chaperone. BiP/GRP78 is normally upregulated during improper folding of membrane proteins.

(2)Sulfo-tyrosine: tyrosine-sulfated proteins , Golgi specific marker.

(3)Tyrosylprotein Sulfotransferase 2(TPST2): is a member of the protein sulfotransferase family。 TPST2 is a widely expressed protein, which catalyzes the O-sulfation of tyrosine residues within acidic regions of proteins。 The TPST2 protein is a type II integral membrane protein located in the Golgi body。

文献导读

文章前提,FGFR4上rs351855突变在各种肿瘤中普遍存在,在肿瘤病患中占到接近50%,所以这个SNP是非常重要的,值得研究的。于是作者构建了这个突变的Knock-in小鼠。

C图告诉我们他们做成了这个小鼠,而且MEF细胞有表型,但是呢,FGFR4的表达没有变,与增殖相关的ERK信号通路也没有影响,看来存在其他通路影响细胞的增殖。于是乎,为了研究这些问题,作者开始了他的“炒作”。下面我们来讲第一张图。

图 1

作者拿WT小鼠的MEF细胞和突变小鼠的MEF细胞作比较,发现细胞表面的FGFR4表达降低,BiP/GRP78和 Sulfo-tyrosine表达升高,这说明FGFR4蛋白折叠出现了问题,FGFR4并没有形成跨膜,而是滞留在了内质网和高尔基体中。可见这个位点的重要性。

图 2

拿到这个数据以后,作者发现这个位点位于跨膜区域,Gly变成了带正电的Arg,会不会将R之后的氨基酸锁在外面了,于是作者运用了生物信息学,拓扑异构学等分析,得出了下图,突变成R以后,R之后的氨基酸序列就暴露出来进入了胞质,但这有什么意义呢?于是乎,作者要”炒作”的概念出来了,明星分子的docking site出来了---YXXQ/C。

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这个位点是STAT3的结合位点,那么检测一下STAT3的磷酸化呗(在这提醒大家,并非所有的蛋白磷酸化形式都是蛋白的活化形式,比如糖原合酶)。

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看STAT3的磷酸化的确增强了,虽然不是那么明显,虽然质量不是很好,但是人家还是发了Nature。后来,作者又做了STAT3启动子的双荧光检测,以及RNAi FGFR4之后看STAT3的磷酸化程度,是不是觉得又不是很明显,别往心里去,告诉你了这是赤裸裸地“炒作”。

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第一张图我们看到了STAT3的磷酸化在突变的MEF细胞里增强,现在我们要看的第二张图就是二者是否有直接的结合,看蛋白相互作用的方法有很多,IP免疫共沉淀就是其中一种。

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用pSTAT3的抗体去IP,转染了突变FGFR4质粒的细胞,FGFR4的确多了那么一些,好像能说明一些问题,但又好像没说到什么,请忽略图片的质量,我们只要关心概念的“炒作”。后面跟着的质谱图检测到了Y 磷酸化,这进一步加强了概念的可信度,因为STAT3对YXXQ的结合需要Y的磷酸化。知道放这些WB图和柱状图不能取信于你,于是作者用了更直接的方法,免疫荧光法。

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作者构建了4个肽段,前面接了Biotin,后面跟着是跨膜的氨基酸,然后是YXXQ或者YXXR,MST1R作为Control出现,当YXXQ变成YXXR时,STAT3便不能结合到这个区域,不能完成下游的激活。

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MST1R中,YXXR没有二者的共定位,YXXQ的在细胞膜和细胞核上都有共定位,同理FGFR4也是如此。WB检测可以看到tm.388R的STAT3的确高了,作者还检测到了EGFR,那是不是EGFR也有作用呢?

作者证明了388位点的变化,使得YXXQ的位点暴露出来,STAT3确实能够结合上去,那么STAT3的招募是不是高效呢?哪一种方式更高效呢?我的问题是这个图有没有必要做呢,咱们继续看第三个图。

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作者改造了STAT3,在N端和C端分别添加了不同的序列。N1为豆蔻酰化序列,N2突变后丧失活性的豆蔻酰化序列,C1法尼基化序列,C2突变后丧失活性的法尼基化序列,C3棕榈酰化序列,这些序列的作用都是能够引导STAT3靠向近膜端。

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检测STAT3磷酸化程度,N端的豆蔻酰化的提升最强,这时候作者把EGFR拉来了,说这种靶向作用是EGFR依赖性的,算是把第二张图的问题给解释了。作者又做了核、质、膜分离检测,核和膜的STAT3磷酸化都进一步的增强。

体外实验做到这了,得做点体内的实验了。

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作者检测了不同器官中的STAT3磷酸化程度,突变小鼠的不出意外地提高了,组织内的FGFR4的表达也不出意外的一致。再看c,d两图,小鼠肺癌模型和乳腺癌模型,STAT3磷酸化程度都有所提高。e,f图Ki67+ 染色结果,突变小鼠的组织更加恶性。

到此为止,文章就算结束了,当然遗留下了很多问题。文章既然能发Nature自然有其理由,除了文章的作者是个大牛以外,无外乎炒作了STAT3 binding cite的这个概念,G-A突变造成了跨膜域的变化,YXXQ位点暴露出来,都是已知的东西,却只有作者辗转腾挪出来,最后发表了高分文章。

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