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病毒宏基因组测序时，需从样本中提取总RNA核酸。总RNA中除含有病毒RNA核酸外，还包含宿主细胞转录RNA。所谓的宿主细胞的转录RNA即是宿主细胞的转录组（transcriptome），是指在特定的生理条件下，细胞、组织或者生物体内所有的转录产物的集合，即转录出来的所有RNA总和，包括编码RNA（mRNA）和ncRNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、cirRNA）等不同类型的RNA分子。在这转录组RNA中，核糖体RNA（rRNA）越占RNA总量的80%，是含量最多的一类RNA。通常这类RNA分子量比较大且代谢不活跃，与蛋白质结合形成核糖体，在mRNA指导下将氨基酸合成肽链。
测序的目的是为了获得更多的生物信息，通常我们需要关注的一般都是mRNA，但是rRNA是在总RNA中最丰富的成员但提供的信息很少，且检测过多的rRNA会掩盖其他基因的表达丰度，故需要想办法将其去除，降低测序成本，提高后续数据分析的效率和精确度。
rRNA 分类：
原核生物的rRNA分三类：5S rRNA、16S rRNA 和23S rRNA。
真核生物的rRNA分四类：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。
在人基因组的四种rRNA基因中， 18S、5.8S和28S rRNA基因是串联在一起的，每个基因被间隔区隔开， 5S的rRNA基因则是编码在另一条染色体上。
去除rRNA
一、实验阶段去除rRNA：
1. 富集法（把目标提取出来），如仅提具有polyA尾巴的mRNA。
PS：在自然界中，绝大多数真核生物核内转录的mRNA，会马上在3‘末端修饰“加尾”180-200个ployA。寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合,这就是提取mRNA最基本的原理.具体到实验手段上,常见有磁珠法、纤维素柱层析法等。
（1）磁珠法一般是用生物素标记OligoT,亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）.实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体,此复合体又与标有亲和素的磁珠结合.用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来.最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即可。
（2）寡聚dT纤维素柱层析法的大致流程：总RNA流经寡聚dT纤维素柱时,在高盐缓冲液中,带polyA尾的mRNA被特异地结合在柱上.降低盐浓度,mRNA被洗脱.一般过两次柱后,就可得到较高纯度的mRNA。
缺点：（1）此方法仅适用于具有polyA 尾的真核生物，不适用于原核生物提取mRNA。（2）对RNA完整度要求比较高，因降解造成的ployA尾断裂的mRNA则无法被富集。（3）无法富集不带ployA尾的lnc RNA,circRNA。（4）无法去除血液中高丰度的球蛋白mRNA。
PS：全血总RNA检测表明600-700碱基区域有显性条带。该条带代表球蛋白mRNA，其在红血细胞（RBC）和网织红细胞（RBC前体）中以高水平表达（虽然细胞核已经丢失，但仍含有高丰度的球蛋白mRNA）。全血总RNA中高达70%的mRNA（以质量计）是球蛋白转录本。去除试剂盒：GLOBINclear™ 试剂盒，人，用于去除球蛋白 mRNA（货号: AM1980），本文所有试剂盒无试用过，仅做记录。
2. 酶消化法/探针法（把非目标去除）
（1）探针杂交+链霉亲和素磁珠去除法
原理：采用生物素标记的DNA探针（与需要去除的RNA可互补杂交）与总RNA中高丰度的rRNA以及免疫球蛋白RNA液相杂交，形成RNA-DNA探针（生物素基团标记）复合物。然后采用链霉亲和素标记的磁珠，结合液相中的RNA-DNA探针（生物素基团标记）复合物和多余探针。分离磁珠和液相，液相上清中剩余的RNA即为去除rRNA等探针针对的高丰度转录本后的RNA，通过沉淀等方式可回收后继续文库构建。称之为Ribo-Zero-seq法。
去除流程： 生物素标记探针与rRNAs杂交 链霉亲和素磁珠去除探针与rRNAs
其他RNA富集纯化
市场占比： Illumina RiboZero与Thermo RiboMinus系列使用该方法
缺点：（1）样本起始量高（一般为1ug）；rRNA残留量高；（2）成本较高。（3）操作复杂，影响实验通量。（4）物种限制性，需要针对不同物种设计不同的探针，虽然某些近缘物种可采用同一套探针，但是去除效果往往有差异，且对物种构成比较复杂的样本（如环境样本等）无法实验。
（2）探针杂交+RNA酶H消化法
RNAse H 是一种可针对性的消化RNA/DNA杂合链上RNA单链的酶，针对这种酶的活性特点，开发出了探针杂交+RNA 酶 消化去除总RNA样本中的rRNA等高丰度RNA的方法。
原理：（1）采用过量的DNA（与需要去除的RNA可互补杂交）与总RNA中高丰度的rRNA以及免疫球蛋白RNA液相杂交，形成RNA-DNA探针复合物。（2）RNase H 针对性的消化RNA-DNA探针复合物上的RNA单链，而未与探针杂交的mRNA、lncRNA 等不受影响。（3）采用DNAse消化剩余的探针；（4）纯化回收未被消化的RNA，可用于后续建库。
去除流程：特异性探针（区分物种）与rRNA杂交 RNase H消化rRNAs
DNase I消化探针
其他RNA富集纯化
市场占比：在市场现有品牌中占据绝大多数。
优点：样本起始量要求低，rRNA残留量更低。与探针杂交+链霉亲和素磁珠去除法相比，杂交探针+RNA酶H消化法效果与其相似，且有成本较低，操作相对简单等优点。
缺点：同样存在物种限制性，必须针对不同物种设计不同的探针，大大限制了该方法的应用范围。
（3）双链特异性核酸酶消化法
Duplex-specific nuclease（双链特异性核酸：DSN）是来源于堪察加半岛红王蟹肝胰腺的一种核酸酶，能特异性的消化双链DNA以及DNA-RNA杂合链，其消化特点是会优先消化反应体系中拷贝数占据优势的核酸，这种特征可用于将总RNA中占绝对优势的核糖体rRNA或其他高丰度RNA拷贝数大大降低，从而将其去除。
原理：（1）以随机引物逆转录片段化的总RNA，形成RNA-cDNA杂交链；（2）以DNS处理逆转录产物，将其中拷贝量占绝对优势的rRNA或其他高丰度RNA形成的绝大部分杂合链消化。（3）剩余的杂合链进行二链合成，构建测序文库。
优点：相对于前述两种需要探针的方法，该方法没有物种限制，对非模式或罕见物种样本，复杂来源样本，环境样本等，均可以使用，大大拓展了转录组测序的应用范围。
缺点：不同的物种rRNA去除效果不同。另外对于其他高丰度RNA也有一定的去除效果，会造成定量的偏差，但研究表明这种偏差一般在10%以内。
参考文献：
