文献： Pan D , Kobayashi A , Jiang P , et al. A major chromatin regulator determines resistance of tumor cells to T cell–mediated killing[J].Science, 2018:eaao1710.
材料和方法（笔记)：
1：细胞培养：B16F10和CD8T细胞
2.转染：
①慢病毒Cas9-Blast载体（具有杀稻瘟菌素抗性）与质粒pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G包装后共转染进入HEK293T细胞
②Cas9-Blast慢病毒感染B16F10细胞并用杀稻瘟菌素筛选得到B16F10-Cas细胞
目的：为了获得高Cas9活性的克隆
B16F10-Cas细胞以单细胞分选入96孔板并用慢病毒感染，驱动Cd274和荧光探针特异性的gRNA的表达。感染10天后，将每个单独的克隆用γIFN刺激，并使用抗-CD274抗体通过FACS测定PD-L1的表达。通过测量转导的（mCherry）群体中PD-L1阴性细胞的百分比来评估Cas9编辑效率。
3.CD8T细胞分离和体外活化
使用试剂盒从Pmel-1和OT-I TCR转基因小鼠中分离CD８T细胞并用抗CD3/CD28玻璃珠刺激新鲜分离的CDT细胞，3天后加入IL-2，6天后将活化的CD8T细胞与B16F10细胞共培养。
Pmel-1转基因小鼠：该转基因株携带重排的T细胞受体转基因，该转基因特异于人SILV（gp100）的小鼠同源物（pmel-17），这是一种由大多数恶性黑素瘤细胞（包括B16黑素瘤）以及正常黑色素细胞表达的参与色素合成的酶。在该小鼠中分离得到 CD8 + T细胞表达Tcra-V1 / Tcrb-V13-转基因TCR，其识别pmel-17表位对应的由H2-Db MHC I类分子提成的gp100的氨基酸25-33。
OT-I T转基因小鼠：该小鼠含有用于小鼠Tcra-V2和Tcrb-V5基因的转基因插入物。设计的转基因T细胞受体在H2Kb（CD8共受体与MHC I类相互作用）的情况下识别卵清蛋白肽残基257-264（OVA257-264）。这导致MHC I类限制性卵清蛋白特异性CD8 + T细胞（OT-I细胞）。也就是说，当由MHC I分子呈递时，该小鼠的CD8 T细胞主要识别OVA257-264。这些小鼠通常用于研究CD8 + T细胞对抗原的反应，阳性选择，以及任何需要具有确定特异性的CD8 + T细胞的研究。
CD3/CD28的作用是刺激从转基因小鼠中分离的CD8+T细胞增殖活化，IL-2的作用是使CD8+T细胞生长并增强T细胞的杀伤活性。
