hello，大家好，周二了，一周最黄金的学习时间，这一篇分享的文献在Comprehensive dissection of immune microenvironment in the progression of early gastric cancer at spatial and single-cell resolution，用单细胞空间的技术来表征胃癌的免疫微环境，这篇文章是国内的学者发表的，我们来看一下单细胞空间技术的运用与科研成果。
Abstract
虽然肿瘤免疫微环境 (TME) 的变化对大多数肿瘤进展具有重要意义，但仍需要能够揭示 TME 的组成和免疫特征的工作。以单细胞分辨率分析胃恶性细胞显示转录异质性表现在胃癌的不同状态，这意味着可能存在不同的细胞状态，包括免疫细胞，all components in TME make some balances in early gastric cancer (EGC) progression。然而，目前尚不清楚免疫细胞如何促成恶性胃炎，构成胃 TME 的一般特征。此外，胃 TME 中细胞间特定相互作用的作用仍有待阐明。在这里，对 18 个胃样本进行了空间转录组和单细胞 RNA-seq 分析，识别了 17 种细胞类型并重建了它们的位置信息。We found that immune cells represented different degree of dysregulations during the progression from non-atrophic gastritis (NAG), atrophic gastritis (AG) to EGC, including imbalance of cytotoxic and inhibitory effects in T cells, maturation inhibition in B cells and malignant genes up-regulated obviously in myeloid cells。此外，通路分析表明，缺氧、活性氧和脂肪代谢信号从 AG 阶段开始被激活，这可能加速 EGC 的进展。此外，细胞相互作用进一步确定了缺氧在胃 TME 中的作用。总体而言，本研究中提供的多组学数据提供了从 NAG、AG 到 EGC 进展过程中胃组织内免疫细胞类型、状态变化和位置的全面视图，促进了我们对不同胃状态的组成和免疫的理解，为 EGC 提供诊断和预防思路（最后都是要对临床进行指导）。
Introduction
大多数肿瘤的进展都是肿瘤细胞与其免疫微环境（包括EGC）之间动态相互作用的结果。在此过程中，胃粘膜组织出现异质性变化和恶性细胞，这在以前已有报道。然而，免疫微环境如何在 EGC 进展过程中发挥作用仍不清楚。结果表明，正常胃黏膜、simple gastritis、AG和GC的炎症细胞浸润、趋化因子和白细胞介素的表达存在差异。据报道，IL33促进metaplasia，其外源性表达可中度诱导表达解痉多肽的metaplasia（SPEM），可能代表慢性胃炎和IM的重要关节。巨噬细胞的典型二元 M1/M2 paradigm消失了，and transcriptionally heterogenous among each cluster was in its place。此外，建立了转移性胃腺癌 (GAC) 的 12 基因预后特征。尽管报道的工作很少，它们不足以说明从 NAG 到 EGC 的过程中的变化。
由于胃免疫微环境的复杂性和技术限制，以前很难对免疫微环境的组成、结构和免疫进行分析。最近开发的单细胞测序（scRNA-seq）、VDJ和空间转录组学（ST）测序已经实现了复杂免疫微环境的识别。作为新技术，scRNA-seq需要消化细胞悬浮，缺乏空间相对定位，而ST测序代表的是空间点图像，细胞分辨率低。然后，从多组学的维度综合运用，不仅用scRNA-seq在单细胞分辨率下准确阐明细胞生物学，而且利用ST甚至免疫文库获取空间位置信息和细胞间相互作用获得 T/B 细胞。结合 scRNA-seq 和 ST 已成功阐明了几种肿瘤和免疫微环境图谱，包括胰腺癌、鳞状细胞癌以及结直肠癌肝转移。因此，考虑应用组合方法来阐明从 NAG、AG 到 EGC 的开发过程中的微环境特征。
在这项研究中，获得了 21,848 个单细胞和 11,347 个空间spot。 通过结合使用 scRNA-seq 和 ST 测序，表征了胃免疫微环境变化的失调。 多组学数据提供了从 NAG、AG 到 EGC 进展过程中免疫细胞类型、状态变化和胃组织内位置的全面视图，促进我们对不同胃状态的组成和免疫的理解， offering diagnostic and preventive thoughts for EGC。
Results
Exploring the spatial architecture and single cell characteristics of the immune microenvironment in the progression of EGC
为了探索胃炎向 EGC 转化的机制，分别确定了来自 NAG、AG 和 EGC 患者的 12 个组织样本的空间特征，这些样本代表了胃癌发展的不同阶段。识别出可区分的肿瘤区域、有或没有 IM 的萎缩区域以及没有明显病变的区域。这些区域的相关性分析表明，各组的非病变区域之间存在差异，更不用说可区分的病变区域。然后，在全局范围内，空间区域的通路活动概况显示出特定的激活模式。与 NAG 组相比，EGC 组的 MYC 信号传导、氧化磷酸化、干扰素 α 反应、IL-1 信号传导、mTORC1 信号传导、TNF 信号传导和髓系白细胞介导的免疫均上调，而 AG 中，脂肪酸代谢、异生素代谢和脂质代谢上调。相反，在 NAG 组中上调的 KRAS 信号通路、天冬氨酸型肽酶活性、B 细胞受体信号通路和细胞识别通路在 EGC 组中均下调。虽然发现通路活动部分与特定细胞类型相关，例如肌肉区域与活化的凝血通路一致。对于大多数通路，它们的活性在每个点上是不均匀的，并且难以与特定的细胞类型匹配，一方面是技术限制，另一方面是复杂的微环境。此外，通过时间轨迹分析，从NAG、AG到EGC细胞有进化趋势，基因表达也有明显变化。鉴于此，使用 scRNA-seq 进一步探索了三组细胞特征和基因表达谱的差异。使用 10x scRNA-seq 从 6 个新鲜的 NAG、AG 和 EGC 胃镜活检标本中收获了 28,860 个细胞。然后对所有细胞进行合并、过滤、归一化、批量校正、聚类，最终确定了通过质量控制的21848个细胞中的17种细胞类型。上皮细胞、T细胞、浆细胞占较大部分，成纤维细胞和壁细胞的细胞数量相近。此外还有内皮细胞、B细胞、肥大细胞、杯状细胞、主细胞等，数量较少。不同组和样本中每种细胞类型的分布是均匀的，表明在 scRNA-seq 数据中没有批次效应。特征基因的表达表明注释的正确性。
探索了每种细胞类型的起源，发现不同组之间存在相当大的异质性。上皮细胞在胃组织中的数量最多，其中大部分来自EGC。parietal cells存在于胃腺中，与标本来源的上皮细胞一致。对于成纤维细胞、内皮细胞和pericytes，从 NAG、AG 到 EGC 减少，表明血管和平滑肌组织逐渐减少，这可能是由于活检标本的采样差异略小。对于chief cells，减少与 SPEM 的特征相符。此外，探讨了在 SPEM 的 GC 进展中涉及的 TFF2 的表达，这意味着 SPEM 可能在我们的研究中发生。此外，值得注意的是，在 EGC 样本中，一组称为增殖细胞的比例最高，表明在胃癌发展过程中增殖能力增强。同时，增殖细胞显著表达CD3D、CD3E等T细胞标志物，提示T细胞在胃癌进展中的增殖能力受到刺激。
然后，使用 SPOTlight(关于SPOTlight，大家可以参考我的文章10X单细胞空间分析回顾之SPOTlight)，对匹配 scRNA-seq 数据的 ST 数据进行反卷积。结果，获得了每个spot的细胞类型成分。除肌层和淋巴细胞聚集区外，上皮细胞分布广泛。 T 细胞和 B 细胞相互靠近，我们观察到在淋巴细胞聚集区，T 细胞和 B 细胞占据了较高的比例。与T细胞和B细胞相比，浆细胞存在于淋巴细胞聚集区的外侧。平滑肌细胞主要存在于肌层，反映在HE上，在一定程度上证明了细胞定位的准确性。Schwann 细胞、pericytes 细胞和成纤维细胞的共定位表明这些细胞和平滑肌可能是肌肉层的主要细胞成分。与其他免疫细胞相比，巨噬细胞更倾向于存在于组织边缘，chief细胞也避开了淋巴细胞聚集的区域，这与上皮细胞一致。此外，还注意到在 NAG 中，增殖细胞主要聚集在淋巴细胞聚集区，而在其他两组中则聚集在上皮区域，这表明增殖细胞可能具有不同的表型和功能，包括 NAG 中的免疫细胞表型和上皮细胞表型。在 AG 和 EGC 中。还存在有趣的现象，NAG中淋巴细胞聚集面积最大，AG和EGC中淋巴细胞聚集面积减小，说明NAG免疫防御功能最强。
先前的研究表明，肿瘤进展通常伴随着增加的拷贝数变异 (CNV)。 然而，CNVs 对 GC 进展几乎没有影响，部分原因是胃组织的全局差异很小。 与之前的工作一致，在从 NAG 到 EGC 的进展过程中，CNV 评分没有显著差异。 数据表明，NAG、AG和EGC组的基因表达谱和微环境细胞特征存在明显变化。
Different expression patterns of T cells from NAG to EGC
我们注意到，在肿瘤微环境中起关键作用的 T 细胞在免疫细胞中所占的比例最大。然后，从三组中提取所有 T 细胞，然后降低维数并重新聚类它们。根据基因表达，我们将 T 细胞分为八个clusters，包括细胞毒性 T 细胞 (Cytotoxic T)、辅助 T 细胞 (Th)、自然杀伤细胞 (NK)、双阴性 T 细胞 (DNT)、调节性 T 细胞 (Treg) 、幼稚T细胞（naive T）、衰竭T细胞（Exhausted T），以及表达高水平上皮相关基因的一种特殊T细胞类群，称为上皮样T细胞（epithium_like）。来自每位患者的 T 细胞分散分布。在不同的 T 细胞样本中发现了很大的异质性。 T细胞的组成和比例在不同的疾病阶段表现出不同的特点。例如，在 NAG 和 AG 阶段，DNT 占较大比例。值得注意的是，一个样本GN1_1，属于AG重度IM患者，T细胞比例与GN1_3相似，而后者与AG相似。这在一定程度上证明了AG是介于NAG和EGC之间的中间状态，而IM是接近EGC的状态。对于 T 细胞亚群，DNT（CD3+CD4-CD8-T 细胞）在总 T 细胞中的比例最高。细胞毒性T细胞和耗竭T细胞仅存在于EGC和AG样本中，随着疾病进展，DNT细胞比例逐渐降低。 Naïve T、Th、NK 细胞呈增加趋势。同时，使用经典标记来表征聚类的正确性。可以看出，标记基因在特定的T细胞中呈现特异性表达。
使用热图显示了 T 细胞亚群的前 10 个DEGs。 热图中 DEGs 的表达进一步验证了标注的准确性。 对于细胞毒T细胞，除细胞毒基因外，KLRC1 25、ZNF68326也高表达，与NK细胞相互作用。 细胞毒性T细胞和衰竭T细胞的基因表达有一定的相似性。 但 DUSP4 在耗尽的 T 细胞中较高，而 DUSP2 在细胞毒性 T 细胞中较高。 激活NK细胞细胞毒性的KIR2DL4在耗尽的T细胞中含量较高，表明细胞毒性T细胞和耗尽的T细胞都可以与NK细胞相互作用。 DNT专注于热休克蛋白相关基因，包括HSPA1A、HSPA1B、DNAJB1、DNAJA1。 DDX3X 与 NLRP3 炎性体的形成有关。 EZR和MYH9与迁移和侵袭等细胞极性有关。
对总 T 细胞的轨迹分析，发现没有明显的发育模式。 然而，当只关注细胞毒性 T 细胞和耗尽 T 细胞时，发现细胞毒性 T 细胞先于耗尽 T 细胞，并且大部分耗尽 T 细胞整体聚集在分支末端，这意味两种细胞之间的转化。 比较了细胞毒性 T 细胞和耗尽的 T 细胞之间功能基因的表达。 对于包括IFNG、NKG7、PRF1、GZMA、GZMB、GZMH在内的细胞毒基因，两种细胞类型之间没有差异。 但对于包括 LAG3、PDCD1、CTLA4 以及 TIGIT 在内的免疫检查点，耗尽的 T 细胞的表达明显更高。 相同的细胞cluster在不同的患者中可能表现出不同的状态，通过寻找DEGs，得到了AG和EGC组中细胞毒性T细胞和耗尽T细胞DEGs的数量。
细胞毒性 T 细胞和耗尽的 T 细胞之间的总通路激活模式相似，而后者的活性更高，除了用于 IgA 产生的肠道免疫网络、WNT β-连环蛋白信号、DNA 甲基化信号传导主要富集在耗尽的 T 细胞中。 比较AG组细胞毒性T细胞和耗竭T细胞，EGC组细胞在TRAF6介导的IRF7激活通路、RUNX3通路、INF信号通路、CXC趋化因子受体信号通路和对肿瘤细胞的免疫反应等通路中表现出更高的活性。
然后，使用 SPOTlight 定位细胞毒性 T 细胞和耗尽的 T 细胞。 两类细胞分布有一定相似性，但细胞毒性T细胞分布范围更广。
在分析 T 细胞亚群时，发现一组既不表达 CD4 也不表达 CD8 的细胞，称之为 DNT。 同时，DNT的数量为1890个，占T细胞的39%，占所有细胞的8.7%。 虽然有一些关于 DNT 的报道，但 DNT 的作用和效果还不是很清楚，而且迄今为止在 GC 中也没有关于 DNT 的报道，那么下面重点介绍一下 DNT。
探讨了 DNT 三组之间的差异。 轨迹分析表明，随着疾病的发展，DNT 会逐步改变。 检查了 DNT 在伪时间的基因表达，热休克蛋白相关基因如 HSPA9、HSPA1A、HSPA1B、HSP90AB1 以及 DEAD-box 解旋酶基因如 DDX5、DDX3X、DDX3Y 逐渐减少。 相反，随着CD8A、GZMK的上调，CD8+ T细胞的表型逐渐显现。 在伪时期后期，JCHAIN基因和IG相关基因在浆细胞中高表达。 DNT pseudotime的基因表达表明向CD8+ T细胞和浆细胞的转变可能发生在DNT的后期发育过程中。
SPOTlight 显示 DNT 广泛分布。 但有趣的是，与其他区域相比，淋巴细胞聚集区域聚集的 DNT 较少。 在癌变部位，DNT含量相对较多。 结合monocle的结果，我们猜测DNT可能转化为CD8+T细胞，在病灶部位发挥抑癌作用。
The dysregulation of B cells development during EGC progression
与 T 细胞相比，B 细胞群在亚组之间表现出较少的数量和多样性。 根据独特的标记基因，这些细胞分为B细胞（CD19、CD20/MS4A1、FCER2和MHC II分子）和plasmas（TNFRSF17、SLAMF7、XBP1、SDC1和IGHs）。 与以往胃组织中含有大量plasmas的研究一致，也发现了迄今为止机制未知的现象。 空间位置也表明plasmas的扩散分布，而 B 细胞稀少。 然而，在 NAG、AG 和 EGC 组之间，B 细胞和plasmas的细胞数量分别相当。
更高分辨率的聚类显示 B 细胞中有 7 个不同的亚组。 B-c0和B-c5主要来源于非EGC组，而在B-c1、B-c2、B-c3、B-c4和B-c6中，EGC和AG组细胞占优势。基因表达分析显示B-c0和B-c5、DDX5、DDX3X和NCL之间相似的上调基因均为抗病原体和抗肿瘤基因。由于大量癌基因在 B-c1 clusters中显著上调，推断它正在恶化由肿瘤细胞诱导的细胞群。然后，通路活性分析表明促肿瘤信号的活性高度上调，这也显示了这些细胞的恶性潜能。对于B-c2 cluster，RGS13、MEF2B、GCSAM和LRMP这些germinal center发育的必需基因被上调。然而，通常在受感染的记忆 B 细胞上表达的 FCRL4，它的过度表达也可能阻碍抗原诱导的 BCR 信号传导。此外，据报道促进肿瘤发展的 ACTG1 和 FAM3C 在该cluster中也上调。对于B-c3，它被定义为表达IGHD和FCER2的滤泡B细胞。 TCL1A、TNFAIP3、BTG1 和 TXNIP、促肿瘤或促炎基因也在该cluster中表达。对于 B-c4，它被定义为记忆 B 细胞，标记基因 FABP5 据报道调节脂肪酸代谢。在 B-c6 中，据报道 SIK2 通过 PI3K/AKT/HIF 轴调节代谢重编程，促进肿瘤进展; WDR76可以激活脂肪代谢限制； CNR2可能抑制抗体反应，据报道是B细胞限制葡萄糖和能量供应的中枢效应物，这反过来表明该cluster与B细胞的代谢变化有关。
TF 分析确定了 IRF8、PAX5 和 SPIB，这是众所周知的对 B 细胞发育至关重要的 TF，CREB3L2 和 XBP1 对浆细胞的成熟。 此外，EGR3、KLF12、MECP2、HDAC1 和 SOX5 的转录活性在 c0-mermory B 细胞和 c5-naïve B 细胞中更高。 相反，FOXP1、HMGB1、EGR1 和 BCL11A 在这些clusters中较低，但在其他 B 细胞cluster中较高。 据报道，FOXP1 在germinal center B 细胞中表现出生理性减少，这意味着 FOXP1 的高活性导致 B 细胞幼稚化。 HMGB1 可在缺氧或炎症刺激后被激活。 BCL11A可以在B细胞的早期发挥作用。 EGR3可以通过抗原受体信号传导和控制炎症来调节B细胞的增殖。 HDAC1可以调节细胞周期的G1-S期转变，它的消融在早期阻断了B细胞。 SOX5对记忆B细胞的发育很重要。
随着对浆细胞的进一步解剖，发现这些细胞具有从浆母细胞、短期浆细胞到长期浆细胞的进化轨迹。 考虑到亲和力成熟期间的体细胞超突变 (SHM) 和类别转换，浆细胞可以获得比 B 细胞更多的变异，inferCNV 分析也表明了这些差异。
有趣的是，空间特征图像显示了胃组织中浆细胞和上皮细胞的弥散分布，另一方面，两种细胞类型之间难以清晰的聚类。 因此，使用 IF 来确定它们的空间位置。 我们发现两种细胞类型之间存在大量邻域关系，尤其是在 EGC 患者中。
由于 NAG、AG 和 EGC 患者之间的 TCR 克隆型不同，分析还确定了 BCR 信息。 从 NAG、AG 到 EGC 组，克隆型的多样性增加。 此外，三组中无论是重链还是轻链的V-J对都是独特且不同的。
Characteristics of myeloid cells in the TME of EGC
然后，剖析了本研究中揭示的骨髓亚群的基因特征。 两个肥大细胞clusters表达了典型的基因模式，例如 TSPAB1、TPSB2、CPA3 和 KIT，并通过 PGA3、NEAT1、HSP90AB1 和 TNFAIP3、AREG、MIF 的独特表达进一步区分。 值得注意的是，先前的研究表明，TNFAIP3的上调可以促进胃癌的发展，而AREG可以增强Tregs的抑制功能。 这两个集群在 EGC、AG 和 NAG 组中显示出不同的富集。 Mast c0 集群在所有三个组中或多或少均匀地存在，而 mast c1 在 NAG 组中几乎消失。 特定的分布可能意味着它们发挥不同的生物学作用。通路评分显示肥大 c0 cluster与 KRAS 信号通路、肠道吸收、ABC 转运蛋白和 Hedgehog 信号通路相关。 Mast c1 cluster倾向于成为恶性细胞群，并显著富集 PI3K-AKT-mTOR、ɑ-TNF、脂肪酸代谢、缺氧、炎症反应和 IFN-γ 信号蛋白。
TF分析表明JUND、MAFF、PRDM1、FOSL2、TCF7L2和HES1在巨噬细胞c0 cluster中被激活，而FOXO1、FOXO3和MEF2A的TF活性在巨噬细胞c1 cluster中较高。 对于肥大细胞，AHR、GATA1、GATA2 是众所周知的 TF，而 RELA、EGR3 和 ZC3H11A 在肥大 c0 clusters中较高。 HIVEP2、ATF4、VDR、ATF5 和 IRF4 在中性粒细胞/DC 细胞中具有更高的活性。
根据C1QA、C1QB、C1QC和CD163的特异性表达鉴定了两个巨噬细胞cluster。其中，三组中显示显著（巨噬细胞c0 cluster）或轻微（巨噬细胞c1 cluster）偏态分布的cluster。 在巨噬细胞c0 cluster中观察到MMP9、CXCL2、MMP12和CTSH的表达，两者在巨噬细胞c1 cluster中均表现出较低的表达。 其余 cluster 是中性粒细胞/DC 群，其特征是 S100A8、A100A9、G0S2 和 LSP1 的高表达。 大部分 cluster 起源于EGC患者，基因表达以及富集途径的活动也偏向于促肿瘤。 巨噬细胞和DC群均表现出抗原呈递细胞（APC）的特征，具有抗原加工和呈递的能力。 除此之外，细胞粘附分子 cams、用于 IgA 产生的肠道免疫网络和补体凝血级联信号也在这些细胞中被激活。
The ligand-receptor interactions of immune cells along with EGC progression（通讯分析）
至于组织微环境，尤其是肿瘤组织中复杂且高频的相互作用。进一步评估了 NAG、AG 和 EGC 组之间的细胞相互作用。三组间分泌信号、细胞间接触信号和ECM受体信号的相互作用强度和数量均不同。与 NAG 组相比，AG 和 EGC 组之间的相互作用数量和强度是可比较的，表明 AG 患者含有驱动早期肿瘤发生的条件。配体-受体的差异分析表明，LGALS9_CD44、LGALS9_CD45、LGALS9 - HAVCR2(TIM-3)、MIF-CD74/CD44、MIF-CD74/CXCR4和MDK-NCL是主要的相互作用。我们发现 LGALS9 在肥大细胞、巨噬细胞、壁细胞和杯状细胞中上调。据报道，LGALS9_CD45 可抑制 B 细胞受体信号 64。LGALS9_CD44 可增强 Treg 的稳定性和功能。此外，LGALS9 可以与 HAVCR2 (TIM-3) 相互作用，以保护乳腺癌免受 T 细胞的细胞毒性杀伤，部分通过诱导细胞凋亡或效应 T 细胞耗竭。据报道，TIM-3是Th1细胞的一种特异性表面分子，可介导Th1免疫反应，其失调可导致抑制炎症反应甚至逃避肿瘤。它可以促进 CD8+ T 细胞耗竭并诱导髓源性抑制细胞 (MDSCs) 的产生。在我们的研究中，TIM-3 主要在骨髓细胞中表达，这与之前的报道一致，即 TIM-3 表达主要定位于人和小鼠肿瘤中的骨髓细胞。肥大细胞中的 TIM-3 可诱导细胞凋亡。巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF) 是适应性和先天免疫的上游调节因子，但如果失调，它是急性或慢性炎症的关键驱动因素，并在白细胞募集中起作用。 MIF发生在AG组和EGC组的多种免疫细胞中。 CXCR4是MIF的受体之一，在EGC组，尤其是B细胞和T细胞群中高表达。据报道，CXCR4可以阻碍其他肿瘤的T淋巴细胞浸润和免疫治疗。 CD74/CD44作为MIF的受体复合物，其激活可触发多种细胞内信号通路，包括ERK通路、PI3K/AKT信号、NFκB和MAPK通路。由于缺氧通路在胃炎条件下被激活，据报道，HIF-1α-和 HIF-2α-依赖性 MIF 可以部分通过与 CD74/CXCR4 复合物相互作用来调节骨髓细胞的功能，然后激活 p38/MAPK 和 PI3K- AKT 信号。另一方面，该复合物还可以作为 B 细胞稳态和成熟的正调节剂。据报道，Midkine (MDK) 支持胃癌的进展，部分是通过抑制颗粒酶 B (GZMB) 的表达和 NK 细胞的细胞毒性，以及通过与表面核仁素 (NCL) 相互作用在缺氧条件下增加表皮生长因子受体 (EGFR) 信号传导）。它还被鉴定为有助于 GC 细胞中的多药耐药性。此外，MDK 重新连接黑色素瘤和胆囊癌的免疫抑制环境。在这项研究中，我们发现与 NAG 患者相比，MDK 在 EGC 和 AG 患者中过表达。 MDK 的受体之一是 NCL，它是生长细胞的主要核仁蛋白，也可作为细胞表面受体在细胞质和细胞核之间穿梭，从而为细胞外调节核事件提供机制。
Discussion
为了探索从胃炎到早期胃癌的免疫微环境变化，首先综合运用单细胞测序和空间转录组技术对免疫细胞成分和空间结构进行了解剖。 虽然之前有过一些胃癌相关的研究，但它们要么集中在胃癌中的恶性细胞，要么仅以单细胞分辨率关注胃癌中的其他非免疫细胞，或者用其他空间方法如 DSP 代替 ST。
全局通路富集和空间区域分析表明，与NAG组相比，AG阶段激活了缺氧条件、活性氧通路和脂肪代谢等多个通路，均有利于EGC的进展和抑制性免疫微环境的形成。 虽然 MYC、INFα、IL-1 和 TNF 信号传导，但所有肿瘤相关通路在 EGC 组中均被激活。 整体变化暗示了组合物的异质性。 然后在这项研究中，发现了多种免疫细胞，包括 T 细胞、B 细胞和骨髓细胞，它们在 EGC、AG 和 NAG 患者中具有不同的状态和表达模式。
当胃病从 NAG 进展到 EGC 时，T 细胞的效应和抑制状态之间的平衡逐渐受损。具体而言，在AG和EGC阶段出现耗竭的T细胞和细胞毒性T细胞，在NAG状态下不存在，免疫反应明显激活。这与先前的研究一致，即早期肿瘤进展伴随着免疫反应激活。除了存在耗尽的T细胞外，TME、Tregs的另一个天然抑制作用，在NAG阶段上调HIVEP1和STAT3的转录活性，而在AG状态增强IRF4和IKZF2的活性，并具有更高的FOXP3转录活性, BATF, 和 EGC 时期的 PRDM1。其中，HIVEP1 是 Tregs 中新发现的 TF，刚刚报道它在 TNFRSF9+ Treg 细胞中高度激活，在轨迹的后期，呈现出与我们的结果不同的模式。正如之前的报道，PRDM1 通常在晚期或终末期上调转录活性，这意味着免疫效果更差。从 NAG 到 EGC 进展过程中转录因子活性的这些变化可能表明 T 细胞的抑制作用是早期胃癌的促成因素之一。以上也表明，AG患者已经开始出现衰竭或抑制性免疫反应，暗示EGC的预防措施可能应从这个阶段开始实施。此外，我们在T细胞中发现了一种罕见的细胞类型，即DNT细胞，它占据了很大一部分，但具有不确定的标记基因来定义它们，这与之前的报道一致。时间轨迹显示了DNT从NAG、AG到EGC的不断演变，没有足够的实验验证，因此它们存在的意义尚不清楚，值得未来进一步研究。
然后，与 T 细胞一样，B 细胞也出现了失调。 FOXP1 和 BCL11A 在cluster（B-c1、B-c2、B-c3、B-c4 和 B-c6）中较高的转录活性，在 AG 和 EGC 组中富集更多，代表 B 细胞的幼年化。 此外，SOX5的转录抑制表明成熟记忆B细胞的丧失，以及正调节细胞周期的EGR3和HDAC1活性较低的成熟障碍。 比较 B 细胞，浆细胞中富含胃组织，与之前的报道相同。 我们发现了一个有趣的现象，即浆细胞共定位或伴有上皮细胞，特别是在 EGC 组中，这通过标记基因表达的 ST 图像和 IF 染色证实。 然而，细胞相互作用无法找到该现象的线索，显示出进一步深入探索的可能性。
有两个恶性clusters，Mast c1 和巨噬细胞 c0，主要富集于 AG 和 EGC 组，表达高水平的基因，促进肿瘤进展并抑制有效的免疫反应。 至于在 Mast c1 中上调的 AREG，可以与 EGFR 相互作用以执行 Tregs 的功能。 主要在骨髓细胞中表达的 LGALS9 可以与 TIM-3 相互作用发挥免疫抑制作用。 此外，MIF-CD74/CXCR4和MDK-NCL均可在缺氧条件下激活，分别调节T细胞或骨髓细胞的功能。
这项研究的优势来自于组合技术的应用：空间转录组学、scRNA-seq 和 VDJ 分析。 Visium ST 使我们能够确定不同组织中细胞类型的位置； 虽然 scRNA-seq 无法像普通 RNA-Seq 那样获得足够深度的基因表达，但它使我们能够确认胃癌进展过程中免疫微环境中的已知细胞类型，以及单独的稀有细胞类型，如雪旺细胞和 DNT 细胞。
Overall, we characterized the dysregulation of immune microenvironment changes both in single-cells and spatial transcriptome resolution, the multi-omics data presented in this study offer a comprehensive view of immune cell types, states change and locations within the gastric tissues during the progression from NAG, AG to EGC, advancing our understanding of the composition and immunity of different gastric states, offering diagnostic and preventive thoughts for EGC.
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