单细胞转录组测序作为区别于传统Bulk-RNA测序的新兴技术，更好的解决了传统研究中存在的细胞异质性问题，为细胞类型鉴定及新细胞类型发现、细胞发育轨迹和功能分析等提供了良好的解决方案，已广泛应用于人类和动物研究。目前植物方面应用范围也在逐步扩大，今天本文就带大家一起看一下2022年2月7日发表在Developmental Cell上的关于拟南芥根系单细胞图谱的文章。
研究背景
在多细胞生物中，转录调控网络精细控制着细胞命运以及器官的发育和成熟。想对此进行全面的研究，需要详细的时空基因表达模式的知识。相对于斑马鱼等动物模型，拟南芥根系基于其简单的结构和无限生长特性，是研究发育轨迹背后时空转录特征的理想模型。然而尽管之前已有部分关于拟南芥根系的单细胞研究，建立了根系单细胞的测序的基本原理并成功捕获到了根系的所有主要细胞类型，目前仍没有超过12500个细胞的根系单细胞图谱测序，只有一个研究推断了三种以上细胞类型的发育进展。此外，每个图谱都只关注了部分的细胞类型和发育状态。因此，目前还没有能够捕捉到所有主要细胞类型的发育状态的全面高分辨率的拟南芥根系图谱。相比之下，动物和人类已有数百万细胞级别的单细胞图谱。
研究结果
1、构建了10万级细胞的高分辨率根系单细胞图谱
在这里，作者对5-7天的野生型和scr、shr突变体拟南芥主根根尖收集了0.5cm的组织进行10X 3’ 单细胞测序，数据统计分析显示共捕获到了96000多的细胞。为了增加数据深度及评估不同实验室间的数据变化，又联合了3个已发表的拟南芥根系数据，建立了一个器官尺度的单细胞图谱。该图谱包含110427个细胞，共检测到24997个基因，这些细胞的中值基因为2768，占拟南芥基因组中编码基因的90%。
进一步通过marker基因注释和novoSpaRc等算法分析，作者成功将这些细胞注释为14种细胞类型，并将其分为4个不同的分支。通过将每个细胞转录组与人工解剖的分生组织、伸长和成熟区对应的基因表达谱进行比较。最后通过已知基因的基因表达谱分析来评估该发育阶段注释的总体准确性。总的来说，该图谱可以准确描述单个细胞类型内部和之间的关系，与前人研究结果相似，每种组织类型都是从中心的年轻细胞辐射向外围分支的老细胞，表明所有主要根细胞类型的分化都是持续的。
2、拟时序分析揭示拟南芥根系细胞发育轨迹
为了更详细的研究根系细胞系的发育进程，作者使用CytoTRACE和scVelo进行了拟时序分析。同时差异表达分析表明基因的表达随着皮层和内皮层的分化逐渐发生变化。类似的，中柱、表皮、侧根冠以及小柱细胞之间，基因表达也呈现出重叠的渐进的模式。
3、OT分析揭示拟南芥根系细胞发育轨迹
进一步的Stationary OT分析（statanaryot optimal transport，平稳最有传输理论）后，研究人员发现Stationary OT推断的发育轨迹在很大程度上独立于图谱注释，不需要将图谱注释并分割为组成谱系即可反映现有的每种细胞和组织类型分化的生物学知识。
为了鉴定可能具有预测细胞类型命运规则的表达模式的转录因子，作者应用了正则化线性回归算法（L1-regularized linear regression）验证了图谱作为丰富的功能特征资源以及Stationary OT方法在研究关键TFs中的作用。
4、scRNA-seq揭示了突变体的分化途径
除了识别新的候选调控因子外，scRNA-seq还可以用来探寻已知调控因子是如何控制组织和器官的发育的。在根的发育过程中，转录因子SHR（SHORTROOT）和 SCR（SCARECROW）对根干细胞生态位的维持和组织模式的建立至关重要。作者研究了SHR和SCR功能缺失时，是如何影响根细胞特性和分化的。过往研究中，shr和scr的突变体层组织形态学检测显示，突变层在shr中具有皮层样属性，在scr中具有皮层和内皮层特征的混合属性。shr和scr的scRNA-seq数据的分析，发现内皮层的标志性基因在shr和scr中显著降低。此外，两个突变体中原木质部细胞丰度降低以及shr中原韧皮部和后韧皮部细胞丰度降低，这与shr和scr中柱发育缺陷的已有报道一致。作者还发现，木质部和韧皮部中柱鞘細胞丰度也显著降低；这一结果验证了shr突变体影响侧根发育的假说。
5、scRNA-seq结果显示scr突变层细胞由皮层向内皮层特性转变
前面讲到，scr中的突变体层具有皮层和内皮层特征的混合属性。那么这种混合特性的出现原因有哪些呢？可能性有多种：1）这些细胞在发育早期分别获得了皮层或内皮层的特性，并在后期共同组成了混合的突变层；2）每个细胞都具有皮层和内皮层的混合特性；3）这些细胞在发育早期只获得了其中一个特性，并在后期转变分化为另一特性。
StationaryOT分析结果发现，scr突变体层同时具有皮层和内皮层的双重特性。与此同时，scr突变体层细胞中年轻的细胞更接近皮层特性，而年长的细胞更接近内皮层特性。相比之下，在shr突变层细胞的所有发育状态中，皮层身份一直占主导地位。在WT根系中，内皮层转录报告基因MYB36和皮层转录报告基因基因AT1G09750（CORTEX）在其各自细胞类型的伸长区表达，MYB36同时也在分生区的内皮层表达。然而，scRNA-seq数据表明这些表达模式在scr突变体细胞层中发生了改变：MYB36在伸长区较老的细胞中和成熟区表达，但不在分生区表达中；CORTEX只在早期延伸区表达。
研究结论
综上所述，本文通过对拟南芥根尖组织的单细胞测序，构建了10万级细胞的高分辨率根系单细胞基因表达图谱，并利用CytoTRACE、scVelo和Stationary OT分析揭示了根细胞系的发育轨迹。同时，研究人员比较了WT和根突变体的scRNA-seq分析结果，从单细胞层面上证明了突变层细胞在shr中具有皮层样属性，在scr中具有皮层和内皮层特征的混合属性，并且scr突变体层细胞中年轻的细胞更接近皮层特性，而年长的细胞更接近内皮层特性。该单细胞图谱作为大数据资源，将有助于研究细胞发育过程中的基因调控网络，寻找相关转录因子以及细胞特性转化的过程中的转录调控机制。
