2020/5/26 今天介绍的文献是美国哈佛大学和麻省理工学院的学者于2019年7月在Cell上发表的，名为Intra- and Inter-cellular Rewiring of the Human Colon during Ulcerative Colitis（人类结肠在溃疡性结肠炎期间出现了细胞内与细胞间的重构）的文献。研究者们分析了溃疡性结肠炎（UC）患者结肠发炎区域、非发炎区域以及健康人结肠组织的单细胞表达谱数据，分析了表达谱和细胞亚群比例的变化是如何促进了炎症的进展，并且如何抵抗抗肿瘤坏死因子（anti-TNF）治疗。另外，研究组也分析了细胞间相互作用的改变与细胞亚群比例变化的关系。
1 研究背景
众所周知，组织是通过多种上皮、免疫和基质细胞的协同作用发挥功能，但是这种相互作用使我们很难确定疾病的因果机制。一个典型的例子是溃疡性结肠炎，其发病机制是环境因素作用于遗传易感人群，引发了肠道微生态的破坏，进而导致免疫失衡和肠道粘膜持续炎症。现有的研究报道的疾病风险等位基因突显了发病机制中的关键途径，然而，处于危险位点的潜在基因尚未全部定位到粘膜中的作用细胞，而且细胞中的作用途径仍是未知的。另外，抗肿瘤坏死因子英夫利昔单抗是溃疡性结肠炎的突破性疗法，但是30％的患者无反应，许多人出现了耐药性，这种治疗抗性如何产生仍然是未解之谜。
过去的RNA测序技术需要对整个组织的表达值进行平均，因此难以测量每个细胞区室的作用。如今，单细胞RNA-Seq技术可以区分细胞表达与细胞频率的变化，来帮助我们，增进对复杂疾病的了解。那么，单细胞RNA测序能够为溃疡性结肠炎做些什么？本文作者提出了以下问题：
（1）借助scRNA-seq，炎症发生时细胞亚群如何改变，哪些细胞亚群高表达了致病基因？
（2）通过比较炎症组织与非炎症组织在单细胞表达谱上的异同。可以了解这些未发炎组织和发炎组织共享的转录改变有哪些。然后，我们关注炎症组织特异性的改变，以确定是什么改变加重了病情。
（3）30%的患者对抗肿瘤坏死因子治疗无反应，还有很多患者在治疗中产生了抗药性。那么，通过单细胞测序，哪些细胞亚群高表达了肿瘤坏死因子？还有，细胞亚群和细胞表达的变化，是怎样导致了抗药性的产生？
（4）通过scRNA-seq，可以探究炎症过程中，细胞间相互作用的重构与细胞亚群比例的变化的关系。
2 研究结果
（1）健康个体和UC患者结肠活检的scRNA-Seq图谱
首先，研究者从18名UC患者和12名健康人的结肠镜检查中获取了活检样本，为探究健康状态向慢性炎症的转变过程，同时减少患者个体特异性的变异，他们收集了每名受试者的配对样本，对于UC患者，配对样本是指在结肠镜下评估为正常组织的非发炎样本，和发炎样本。这样，得到了三类不同样本：健康组织样本、UC患者的非发炎样本和发炎组织样本。然后，他们将组织样本分别处理为上皮组织和固有层组织，分别单细胞RNA测序。
（2）单细胞测序和聚类结果展示了肠道粘膜的51个细胞亚群及其分子特征
根据得到的测序数据，对细胞进行聚类分群。首先，根据已知的标记基因的表达，将每个样本中的所有细胞初步分为上皮、基质和免疫细胞。然后，在初步分成三类的基础上，对每一个类，经过可变基因选择、批次校正、PCA降维、KNN聚类，一共鉴定到51种细胞，包括15种上皮细胞、13种基质细胞和23种免疫细胞，t-SNE算法生成的二维嵌入可视化的结果如图所示。这里的每一个点代表了一个细胞，相同颜色的点表示同属一个细胞亚群。
然后，研究者进行了单细胞的差异基因表达分析。该图展示了每个亚群的top10的差异基因的热图，x轴代表了细胞亚群种类。y轴代表了差异基因种类。热图中的颜色代表了基因的表达水平。从这张图可以明显的看出，每个亚群的差异基因是比较特异的，而这种特异性的基因理论上可以作为该细胞类型的Marker基因，用已知的Markers对每个细胞亚群进行了标注。
根据聚类结果和差异基因表达分析，介绍了两种健康结肠中的新的结肠细胞亚群，表达BEST4的肠上皮细胞与其他上皮细胞不同，具有pH感受和电解质平衡相关基因的富集，包括耳蝶呤2和3（OTOP2/3）、检测pH和感受酸味的质子通道、催化碳酸氢盐形成的碳酸酐酶VII（CA7）和输出碳酸氢盐的BEST4。多个成纤维细胞群有不同的WNT/BMP信号基因，可能反映了隐窝和绒毛的不同位置。在隐窝附近的有WNT2B，WNT4和DKK3的富集，而在绒毛附近的有BMP4、BMP5和WNT5A/B的富集。这些基因有许多是上皮下的telocyte，那是支撑上皮的一小群成纤维细胞。WNT2B+成纤维细胞通过R-spondin-3与LGR5互作，支撑ISC niche。RSPO3+成纤维细胞表达其他WNT/BMP基因和几种不同的趋化因子。
（3）UC患者中细胞组成与健康人有显著差异
与健康对照组相比，非炎症或炎症样本中，许多细胞亚群的比例均存在显着差异，例如CD8+IL-17+T细胞、调节性T细胞、M样细胞和炎症相关的成纤维细胞（IAFs）亚群在炎症进展过程中显著扩增。其中，M样细胞中IBD风险基因的表达水平也非常的高（图4黄色框图，CCL20和CCL23）。IAFs高表达与结肠炎，纤维化和癌症相关的基因（图4紫色框图，IL11，IL24和IL13RA2）。另外，在B细胞谱系中，存在着浆细胞比例下调和滤泡细胞上调的过程。
（4）疾病过程中大多数表达变化是由非炎症和炎症组织共享的
为了确定与疾病相关的表达改变，研究者们根据Finaket al 于2015年提出的算法，将在某种疾病状态下的，每个基因在特定细胞亚群中的“表达”建模为反映细胞亚群、疾病状态和细胞内基因检测数的总和。这种算法引出了一个称为差异表达系数的概念。差异表达系数，是由Finak等人提供的MAST算法R包，将上述参数代入方程自动计算出来的。表示在一个特定细胞亚群中，相对某种疾病状态，在另一种状态下的，差异基因表达改变的程度，DE系数绝对值越大，说明相对前一种状态，后一种状态中该基因在该细胞亚群中的表达差异越大。DE系数为0，则表示这种基因在某种细胞亚群中，对于两种疾病状态，表达没有区别。
右图G，横坐标表示非发炎组织与健康组织的DE系数，纵坐标表示发炎组织与正常组织的DE系数，每个点代表一个特定的细胞亚群在某一基因中三种疾病状态两两比较下的两种DE系数，越接近图中的回归线位置，说明这部分细胞亚群在这些基因中的炎症和非炎症状态下都没有显著区别。可以看到，大部分点都位于回归线附近。这说明，大多数表达改变，在非炎症组织和炎症组织中共享。这进一步说明UC的转录特征在发炎之前就存在，或在消退后持续存在。可能提示了一种临床意义：对于UC患者活动期发生后的临床干预可能要持续到炎症消退后的一段时间，另外可以通过转录组分析，在结肠镜下出现炎症组织前，就预测UC的发生。
图A-F是炎症和健康组织的差异基因表达分析的火山图，ABC分别代表了上皮，基质和髓质或适应性区室中所有细胞亚群之间的综合变化。DEF代表区室中特定细胞亚群的独特变化。结果提示，上皮细胞的DE基因反映了通过激活固有免疫恢复自稳，比如上调抗微生物和抗氧化物防御通路，黏蛋白生物合成和 II类主要组织相容性复合物的机制。在基底层中，成纤维细胞诱导炎症、纤维化和组织修复相关的基因，而内皮细胞的变化支持组织的血管形成。免疫细胞中，髓样细胞和T细胞激活共刺激和共抑制基因，B细胞高表达IgG类别转换基因。
（5）溃疡性结肠炎患者结肠上皮细胞的代谢变化，T细胞亚群中诱导促炎性IL-17反应和免疫检查点
研究者对炎症过程中的239个KEGG通路的变化作图，揭示了肠上皮细胞的代谢变化，包括从氧化磷酸化到糖酵解的转变，精氨酸生物合成酶的诱导（例如，NOS2和ASS1），以及用于降解支链氨基酸的酶的下调，尤其是AUH（一种推定的风险基因）。肠上皮细胞还诱导了HIF1途径，这是单核细胞糖酵解转变的一个原因。这些变化可能是由于肠道细菌短链脂肪酸生产受损所致，因为上皮细胞下调了β-氧化途径以及丁酸和丙酸的代谢途径，但上调了膳食脂肪酸的途径（例如，α-亚油酸）。
可以看到，UC期间，红色框图指示的几个CD4 +亚群上调了IL17A，可能反映了IL17A表达的每细胞增长。蓝色框图指示了，在两种疾病状态下CD8 +亚群对IL17A的诱导最强。黄色框图指示了，T细胞的大多数亚群诱导了共刺激和共抑制程序，与抑制慢性免疫激活的尝试一致 。
（6）IAF和单核细胞通过OSM通路抵抗TNF抗体药物
我们知道，单克隆抗TNF抗体是IBD的突破性疗法，但是30％的IBD患者无反应，并且许多人获得了耐药性。是哪些细胞亚群在炎症发生中高表达了肿瘤坏死因子？还有，细胞亚群和细胞表达的变化，是怎样导致了抗药性的产生？图9A分析了健康，未发炎和发炎的样中每个细胞亚群表达的总TNF转录本的分数。结果表明，肿瘤坏死因子的表达在UC期间发生了变化，Treg细胞成为TNF表达的关键角色。单分子荧光原位杂交和免疫荧光测定结果也验证了FOXP3+IL10 +TNF +细胞的扩增。
IAF中表达最活跃的基因之一是推定的风险基因OSMR，以及预测抗TNF反应的细胞因子抑瘤素 M（OSM）的受体。OSM和OSMR过去被认为分别由未知的髓样和基质细胞表达。OSM最富于炎性单核细胞和DC2，而OSMR最富于IAF。伴随着炎症过程中这些亚群的扩增，上述发现使我们假设结肠的细胞重塑可能部分解释了OSM与耐药性之间的关系。
研究者们采用Wang等人于2016年提出的一种对耐药性和敏感性的基因信号的评分机制，对各个细胞亚群的抗TNF的耐药性和敏感性的基因信号进行了评分。结果表明，药物抗性信号在IAF、炎性单核细胞和DC2细胞中大量富集。与耐药性最相关的三个基因IL13RA2，TNFRSF11B和IL11是 IAF的marker，在其他细胞中很少表达。
研究者们又设计了一项逆向分析，测定并分析了20个抗肿瘤坏死因子治疗反应者，27个无反应者和健康对照组的治疗前的上皮、炎症相关单核细胞和IAF的bulk抗药性信号表达数据水平。证实了IAFs丰富的患者会对抗TNF治疗产生抵抗。因此，IAF可能与West等报道的OSM介导的抗性有关。潜在的耐药机制是OSM与TNF协同作用或表型复制，OSM的表型是TNF，激活了IAF中的下游靶标。IAF和炎性单核细胞可能会在TNF阻滞期间补偿，从而导致耐药性。
（7）细胞-细胞相互作用的重构解释了疾病期间细胞比例的变化
接下来我们进一步探究炎症发生时细胞亚群间相互作用的变化。如图ABC，我们将受体-配体对映射到细胞亚群上，以构建细胞间相互作用网络。每个节点指一种细胞亚群，颜色代表谱系关系，面积代表细胞比例。浅灰色和深灰色的线分别连接了疾病期间，相对健康状态下的同源受体—配体对表达显著增加 (p < 0.05)和差异表达(p < 0.05)的细胞亚群。
可以看到，健康状态的相互作用网络描绘了不同的细胞区室。而随着疾病的进展，谱系间的串扰不断增强，区室化不断减少。与健康组织相比，炎症组织显示B细胞与T细胞，巨噬细胞和CD8 + IL-17+ T细胞之间的相互作用发生重构。右图D显示了各细胞亚群在健康，非发炎和发炎网络中的平均网络居中性，Y轴表示亚群种类，x轴表示平均居中量值。图中显示了排名最高的10个细胞亚群的平均值。可以看出，M样细胞，IAFs和炎性单核细胞是细胞间相互作用网络中最核心的节点，表明其在溃疡性结肠炎的细胞间相互作用中起到了介导其他亚群的作用。
那么，是什么导致了细胞亚群比例的变化呢？研究者们假设这种比例的变化可以用细胞-细胞相互作用基因的变化来解释。为了验证假设，我们检索了所有细胞亚群对，对于每个受体-配体对，检查样品中一个细胞亚群中配体的表达水平是否与样品中表达其受体的细胞亚群的比例相关。每个小图显示，对于通过受体-配体相互作用连接的一对细胞，x轴所代表的配体在一个细胞亚群中的平均表达水平和y轴所代表的表达受体的细胞亚群的对数转化比例中的每个样本，颜色标记了每个样本的疾病状态，可以看到配体的表达水平和受体的细胞亚群的比例呈正相关关系。证明了细胞亚群比例的变化可以用其他细胞表达的细胞-细胞相互作用基因的变化来解释。
3. 研究总结
（1）从肠粘膜中鉴定出51种细胞亚群，主要是上皮、基质和免疫细胞；
（2）M样细胞、炎性单核细胞、炎性成纤维细胞（IAF）、CD8+IL-17+T细胞，在UC中增多，表明其在炎症产生中发挥了关键作用；
（3）炎性单核细胞和IAF可能分别通过表达抑瘤素M（OSM）及其受体，介导抗TNF治疗的耐药性；
（4）细胞间相互作用的重构解释了细胞亚群比例的变化；
（5）M样细胞、炎症相关性成纤维细胞和炎症相关性单核细胞是疾病期间细胞相互作用网络中的关键位点。
