三代测序(Nanopore)

一、测序原理

先介绍 Nanopore 测序中的几位主角:

Reader :在自然界中,有一种可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白,具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后,得到的就是 Nanopore 测序所需的 Reader 蛋白。

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Membrane:Reader 蛋白会被嵌入到高电阻率的 Membrane (人工合成的多聚物膜),膜两侧是离子溶液,在两侧加不同的电位,离子就会在孔中流动,形成电流。

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Motor:在 Nanopore 文库构建时,需要在接头上连接一种动力蛋白,用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。以DNA解螺旋酶作为 Motor(动力蛋白)为例,它可以除了可以解开双螺旋,使之变为单链,还可以提供推动力。

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Tether:该蛋白用于锚定DNA或RNA链,防止在溶液中飘动,并使其进入纳米孔中。

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这时,解开的其中一条链会穿过蛋白质孔,它在通过蛋白孔时,会对膜两边离子的稳定流动产生扰动。不同的碱基,对离子流的影响不同,也就会产生不同的电流大小,进而形成下面的电流信号图。

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利用这些电流信号,使用计算机软件识别后,推断出碱基类型,完成测序。

二、测序仪介绍

虽然 Nanopore 测序仪种类很多,但都是基于Nanopore芯片来搭建的平台,大到由多个芯片阵列组成的PromehION,GridION系列测序仪,小到可以连接手机的Type C,电脑USB的MnION系列便携式测序仪。

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这里边,最著名的就是MnION系列,2016年8月,美国宇航员凯特·鲁宾斯在国际空间站完成微重力条件的DNA测序。

它在测序时,一般像下图这样连接就行,显而易见的便携性。比如,可以直接用它在深入疫区采集样本后进行实时分析,为防疫工作争取大量宝贵的时间和资源。

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测序时,将制备好的文库或样本溶液,滴在芯片小孔中,开始测序。

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一张芯片中有 2048 个 membrane wells,也就是芯片上的一个孔,每个孔包含一个nanopore Reader。

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每四个 wells 共享一个 Amplifier(信号放大器),一张芯片中有 512 个信号放大器,也就是 512 组 wells。

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在启动测序仪后,机器自检,会将每组 wells 中依据效率高低排序。测序开始,仪器先用每组 wells 中效率最高的 wells,运行 8 小时后,更换效率第二的,以此类推。

但是,在实际使用过程中,只有 1200 个 wells可以正常工作。

造成 wells 失效的原因:

  • wells 中没有 Reader 蛋白,或纳米孔不通,这时无电信号

  • 膜破损,这时有强电信号,不能正常测序

  • 在单个 well 中有两个及以上的 Reader 蛋白,电信号互相干扰

三、建库方法

1、1D 文库

1D文库是将DNA双链,解链为正义链与反义链,分别测序,大约有 85% 的碱基判读准确率。

目前1D文库有两种建库方案:

标准建库
  • 将 DNA 打断

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  • 补齐DNA末端,末端加 A 碱基

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  • 连接 Adapter( 接头序列),接头上连有 Motor 蛋白

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  • 接头中有一段序列可以与 Tether 蛋白结合,作用是为了将 DNA 链吸附在膜上,将 DNA 锚定,不易被溶液洗走

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    下图是 Tether 与接头序列识别及锚定过程

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转座酶建库
  • 建库时使用连有测序接头的转座酶,该酶可以将长链 DNA 链切断

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  • 由于该酶的特性,会在DNA的断点两端加接头序列

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  • 随后在测序接头加入 Motor 蛋白

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2、​ 文库

在 DNA 两侧接 ​ 接头,其他步骤和 1D 文库类似。

这种文库中的​ 接头,可以让第二链紧跟第一链来一起测序。

由于可以测到两条链,可以相互矫正,进而提高判读准确率,能达到 90%以上的碱基判读准确率。

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但是,由于文库质量,蛋白活性等因素,导致并不是所有的第一链后都会测到第二链。

四、碱基判读

在测序过程中,得到的信号并不是每次测得一个碱基信号。而是根据 Reader 蛋白孔的纵向长度,R9 大约为 5 个碱基长,也就是说,同时会测得 5 个碱基的电信号,这并不是一项简单的判断过程。

目前,Nanopore 公司采用一种机器学习方法,递归神经网络(RNN),对碱基进行判读。

该过程简单来说,是将已知碱基序列的电信号波形图做训练集和测试集,通过修正参数,拿到模型。最后,将新测到的未知序列的波形图与之比对,从而提高判读准确率。

但是,还是有误读情况:

  • 由于空间结构相似性,嘌呤间误读,嘧啶间误读更容易发生。

  • 碱基复杂度低的序列(如,polyA序列),更容易误读

五、测序影响因素

电压

以R9芯片为例,测序过程,先用 180 mV 电压,每 10 min,短时间翻转电压方向,作用是激活被堵住或卡住的 Reader 蛋白孔。但是,这个过程也会使正常测序的 DAN链倒吐回去。

随着电极使用时间的增加,电极的电压会发生漂移,因此每过两小时,要增加 5mV 电压抵消影响。

速度与产量

R9 芯片,测序速度是 250 碱基/s,一张芯片可以得到约 5 ~ 10 G的碱基序列。

六、芯片版本号

Nanopore 公司每一种新Reader蛋白,Motor,Membrane,就会有一个新的芯片版本号,一般命名规则如下:

  • Reader:R8,R9,R10,等

  • Motor:E6,E7,E8,等

  • Membrane:M9,M10,等

比如,R9 指的是大肠杆菌的 CsgG 蛋白质改造的 Reader 蛋白。

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总结

  • Nanopore 测序是基于电学的检测,区别与 Illumina 和 PacBio 的光学

  • 测序仪器便携,可用于远离实验室的地区,如疫区,农场等

  • 读长较长,大约 300,000 ~ 400,000 个碱基,可用于从头组装基因组,可变剪切等

  • 可以对DNA ,RNA,甚至蛋白质序列进行测序

  • 碱基判读准确率较高,R10纳米孔数据质量值超过Q40(即错误识别的概率是0.01%,即错误率0.01%),一致性(Identity)质量值达Q50 (99.999%的碱基准确率)。

参考:

https://www.youtube.com/watch?v=RcP85JHLmnI

https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw&t=13s

https://www.youtube.com/watch?v=sv9fFeSd3kE

https://nanoporetech.com/

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