九、致病性链球菌-G+、甲乙型溶血性、丙型；ABCD等20群Lancefield分群

• 非侵袭性（即浅表性）感染：咽炎、脓疱病、丹毒、阴道炎
• 侵袭性感染：菌血症、蜂窝织炎、新生儿败血症、心包炎、脑膜炎
• 毒素相关：猩红热、毒素休克综合征STSS
• 变态反应性疾病：风湿热、急性肾小球肾炎

G+！常见化脓性球菌，广泛分布
血平板溶血现象分类

1. 甲型溶血性链球菌：1~2 mm溶血环，草绿色溶血环，α溶血
2. 乙型溶血性链球菌：2~4 mm，界限分明、完全透明溶血环，β溶血
3. <u>丙型链球菌</u>：无溶血环、不产溶血素，一般不致病。

(一)化脓性链球菌

1. 采取标本
   急性期，抗生素之前最佳
   冷藏运送，1天内、最好＜2天
2. 病原分离
   含5%脱纤维羊血的胰酶消化大豆琼脂(TSA)培养基，增菌用THB肉汤
   脓液、咽拭子直接血琼脂平板，血液、脑脊液先增菌→划种血琼脂平板
   35~37℃，24 h，灰白色、透明or不透明、有乳光、圆形突起小菌落
   显微镜下链状排列，液体培养基中形成长链，48 h、可提高检出率
3. 病原鉴定
4. 杆菌肽敏感试验：95%A群链球菌对杆菌肽非常敏感、抑菌环＞10 mm，血琼脂平板、肉汤培养物涂抹
5. CAMP试验：血平板上B群链球菌、产生CAMP因子，促进金葡菌β溶血素活性。
   B群鉴定指标！血平板上、金葡菌直线，待检菌垂直平分线，35℃过夜，矢形(半月形)加强溶血区，CAMP+
6. 马尿酸钠水解试验：B群具马尿酸钠水解酶。接种于马尿酸钠培养基，35℃48 h，离心上清液＋FeCl3试剂，恒定沉淀+ →推断为B群
7. 七叶苷水解试验：Ｄ群链球菌水解七叶苷，生成葡萄糖＋七叶素，七叶素＋枸缘酸铁Fe2+→黑色沉淀物。接种于七叶苷培养基，35℃过夜，变黑+
8. 6.5%NaCl生长试验：D群链球菌耐盐能力强，接种6.5%NaCl琼脂培养基，35℃过夜，长菌落&变黄！+，不长-
9. 血清学试验：细胞壁的多糖抗原不同，ABCD等20群，Lancefield分群，致病链球菌90%为A群(杆菌肽)
10. 快速检测方法
11. 酶标免疫测定法：A群，咽拭子，10分钟鉴定是否A群
12. 聚合酶链反应：特异扩增A群的致热外毒素A、B、C基因speA、speB、speC；溶血素O基因slo
13. 抗体检测
    常用抗体为“抗溶血素O”ASO。溶血法&乳胶凝集法，主要用于辅助诊断风湿热&肾小球肾炎。

(二)肺炎链球菌（G+！有荚膜！矛头状肺炎双球菌--奥普托欣试验、胆汁溶菌试验、菊糖发酵试验）

机体内形成荚膜（<u>☆荚膜肿胀试验</u>）
兼性厌氧、<u>营养要求高</u>、培养基需含血液or血清
37.5℃、pH7.4~7.8、初次培养需CO2孵箱。血琼脂平板上细小、灰色、有光泽扁平菌落，草绿色α溶血环

1. 采取标本
   根据病种：痰、脓、血液or脑脊液
2. 镜检
   痰、脓、脑脊液沉淀物→涂片革兰染色，典型G+、具有荚膜的矛头状双球菌
3. 病原分离
   直接画线接种血琼脂平板，37℃、24 h，挑取α溶血可疑菌落做鉴定，脑脊液和血液需先血清肉汤增菌。
4. 病原鉴定
   肺炎链球菌主要与（甲型溶血性链球菌）鉴别
   <u>奥普托欣试验、胆汁溶菌试验、菊糖发酵试验</u> 最常用。
5. 奥普托欣试验：可疑α溶血性菌落涂于血琼脂平板，直径6mm“P”纸片or奥普托欣纸片中央→CO2孵箱or烛缸、35℃、18~24 h→＞14mm生长抑制区带为+、α溶血菌株是肺炎链球菌。无生长抑制区带的→产毒性链球菌。9~13mm生长抑制区带→胆汁溶菌试验
6. 胆汁溶菌试验（平板法也可，新鲜平板，10%脱氧胆酸钠1滴，15 mins）：菌株悬于0.5ml盐水，0.5麦氏单位密度标准→分2份0.25ml，＋0.25ml盐水/2%脱氧胆酸（胆盐）→轻摇后35~37℃、2 h→（细胞裂解）管液清澈or浊度消失为+，肺炎链球菌。

(三)猪链球菌

35个血清型，最常见2型（R群）、1型,7型、9型也致病。

1. 采取标本
   血液、脑脊液、腹水、实质脏器→直接涂片、革兰染色→G+球菌
2. 病原分离
   直接涂布新鲜羊血琼脂平板分离，脑心培养基or血培养瓶增菌。
   选择性培养（15μg/ml多粘菌素B，30μg/ml萘啶酮酸的脑心培养基）增菌→新鲜羊血琼脂平板、37℃、烛缸or 5%CO2、24~72 h→α溶血的可疑菌落涂片&革兰染色→G+球菌
3. 病原鉴定
4. 生长特性：10℃、45℃、6.5%NaCl、pH 9.6、麦康凯培养基条件下不生长
5. 生化试验：V-P(-)、马尿酸盐(-)、乳糖(+)、葡萄糖(+)、淀粉(+)等。。。。
6. 深入鉴定
   PCR特异基因等

十、钩端螺旋体（钩体、钩体病，G-、人兽共患病，Korthof、EMJH培养基、显微凝集试验MAT）

钩端螺旋体下有2个种：

• 问号钩端螺旋体（致病性）
• 双曲钩端螺旋体（非致病性）

G-、酸碱敏感pH 7.2_7.5、2830℃、需氧or微需氧，生长慢
由柱形原生质体、内鞭毛（轴丝）、外膜组成。

1. 采取标本
   血液、脑脊液→抗凝剂试管（不可用枸橼酸钠-抑制钩体生长）<u>5~20℃</u>保存、一周内接种培养基。
   尿症期→中段尿液→1%牛血清白蛋白将尿液稀释10倍→5~20℃保存数日
   眼部并发症→眼房水
   羊水，地表水、死亡数小时内→内脏or骨髓
2. 病原分离
   血液中含生长抑制物，1~2滴血液or0.5ml脑脊液接种到5ml培养基（<u>Korthof</u>、EMJH培养基）2管
   尿液→磷酸盐缓冲液1:10、1:100稀释→取50μl接种5ml培养基（加入新霉素滤纸片or5-氟尿嘧啶）
   器官组织：肾皮质小米粒组织块-研碎
   环境水样：3ml注射豚鼠腹腔，4 h取心血培养，4 weeks取血液、肾、脑培养&血清学试验。
   室温（20~30℃）培养所有标本、暗视野显微镜、1滴培养物、每周查一次、5周。每月查2次、4个月→阴性。
   阳性通常1~2周培养：培养液透明、轻度乳光、摇动-云雾状浑浊，镜下运动活泼、1端or2端有钩
3. 病原鉴定
4. 钩体血清“群”鉴定：显微凝集试验MAT，兔免疫血清、PBS倍比稀释1:20~1:3200、96孔板、每孔50μl菌悬液、37℃2 h、暗视野显微镜、50%菌体凝集的最大稀释度为“凝集滴度”。
   血清型水平→交叉凝集吸收试验、参考实验室
5. 钩端螺旋体鉴定：分子生物学技术
6. 抗体检测
7. 收集标本：急性期、恢复期双份血清，56℃水浴30 mins灭活。间隔1周
8. 抗原制备：国内15群15型钩体参考株接种培养基，28_30℃培养57 d，≥50条/高倍视野(400×)，运动活泼无自凝。
9. 血清盐水稀释，50μl，96孔板，参考株钩体活菌，37℃孵育2 h。50%菌体凝集→最大稀释度、凝集滴度，4倍↑-诊断意义。

十一、莱姆病原(1985年我国发现。BSK培养基、蜱、鼠-宿主、发酵代谢产物--<u>乳酸</u>，与梅毒、钩端螺旋体不同）

伯道疏螺旋体：左旋、10~40μm、(表层、外膜、鞭毛、原生质柱)、BSK培养基
G-、发酵代谢产物--乳酸，与梅毒、钩端螺旋体不同
☆1985年我国发现

1. 采取标本
   血液、尿液、脑脊液
   蜱传播媒介，鼠是主要“宿主”，采取标本。
   -20~4℃运送
2. 镜检
   蜱中“肠”，鼠、病人组织制成悬液，暗视野显微镜直接检查。
   涂片→组织学染色、特异直接荧光抗体染色→用于动物调查、病人快速诊断（检出率低）
3. 病原分离
   鼠类组织、蜱中肠、病人血0.2~0.5ml，红斑周围皮肤组织→接种BSK培养基、33℃培养，每周暗视野显微镜检查1次，及时传代。1个月后阴性则盲传一代。
4. 病原鉴定（需要荧光显微镜）
   间接IFA鉴定：兔抗B31特异性多克隆抗体or莱姆病特异单克隆抗体(4倍↑or≥1:256诊断)
   PCR基因分型--if致病基因型
5. 尿液检测
   PCR尿液特异DNA片段
6. 抗体检测
   ELISA、IFA(4倍↑or≥1:256诊断)、WB（最终确诊方法）

十二、布鲁氏菌(肝浸膏琼脂培养基、噬菌体裂解Tb、血清试管凝集试验SAT、虎红平板凝集实验RBPT、乳环凝集实验）

一组球状、球杆状、短杆状细菌 ，无鞭毛、无芽孢。光滑型有荚膜，G-
专性需氧，37℃、pH6.6_{6.8，部分初次分离需5%}10%CO2，高营养、生长慢、48 h微小、无色、透明、凸起、光滑型菌落，无溶血。
布鲁氏菌属、6个种19个生物型：羊种1_3，牛种17，猪种1~5，犬种，绵羊附睾种，沙林鼠种。

1. 采取标本
   血、组织→双相培养基？。血→注入培养管
   血清凝集试验
2. 病原分离
   肝浸膏琼脂培养基、商品布鲁司琼脂、布鲁司肉汤、土豆浸液琼脂、蛋白胨琼脂
   生物分离方法，1ml注入豚鼠体内。
   镜检可排除非布鲁氏菌，但不能鉴定布鲁氏菌！
3. 病原鉴定
   分离到纯种菌株后进行：阳性血清玻片凝集、A、M因子血清凝集、培养的CO2需要&H2S的产生
4. 深入鉴定
   噬菌体裂解，常用Tb、Wb、Iz、Fi等噬菌体（要求参考菌株对照）
   也可单独使用Tb噬菌体的RTD&10^4RTD裂解实验。
   染料抑菌实验：纸片法&培养基稀释法
   参考PCR实验
5. 抗体检测
   血清试管凝集试验SAT（1:100++以上），须排除共同抗原微生物的交叉反应
   虎红平板凝集实验RBPT（一定时间内裸目看到）、补体结合试验CFT（1:10++）、抗球蛋白试验（1:100++）、免疫荧光试验IFT、2-巯基乙醇2-ME、半胱氨酸凝集试验CAT、ELISA
   动物鲜乳→乳环凝集实验（<u>布鲁氏菌乳环抗原</u>）

十三、炭疽病原（大质粒pXO1、小质粒pXO2、毛玻璃样、狮鬃样菌落）

炭疽芽孢杆菌。有芽孢、有荚膜、产外毒素
毒素基因位于（大质粒pXO1）荚膜基因（小质粒pXO2）致病所必需，缺少使毒力减弱or消失
土壤中存活数十年

1. 采取标本
2. 皮肤：溃疡周围采渗出液；肠型：采粪便；肺型：痰液or咽拭子；
   血液标本都要采
3. 牲畜：血液&脏器，特别注意‘腔道流出的血",穿刺采取-避免扩大污染
4. 特别注意动物地点土壤标本，动物制品-生理盐水浸取or拭子涂抹取样
5. 镜检（特别重要）
   首先涂片，革兰&荚膜染色：大量、均一的两端平齐G+的巨大杆菌→临床诊断
   荚膜染色：菌体周围明显荚膜，诊断+1
6. 病原分离
   沸水浴20mins后接种。可使用普通、血琼脂、选择性培养基。
   营养需求低，普通培养基上生长良好。菌落灰白色、表面干燥呈“毛玻璃”样，稍隆起。
   镜下菌落边缘卷发样条索纹理→“狮鬃”样菌落
7. 病原鉴定
8. 溶血特征：血平板上不出现溶血环！
9. 显微镜检查：G+粗大杆菌、无鞭毛、棒状、两端截平，人工培育：竹节状长链。芽孢-菌体中央。
   荚膜：美兰染色--淡蓝色荚膜，墨汁负染色--荚膜明显轮廓。
10. 青霉素敏感试验&串珠试验：10 IU/ml青霉素溶液滤纸片、37℃8~10 h→明显抑菌带。“琼脂片、载玻片上、接种待检菌、青霉素滤纸条、37℃3~4 h”→临界处、荚膜肿胀的串珠状菌链。
11. 噬菌体裂解试验：AP631株--炭疽噬菌体我国选育，形成透明噬菌斑
12. 毒力鉴定
13. 质粒电泳图谱分析：分离获得的菌株→提取质粒→电泳分析→确定2个质粒存在→判断毒力完整
14. PCR扩增：最常用手段
15. 抗体检测
    缺乏本底抗体水平资料，双份血清滴度4倍↑，才能诊断。

十四、斑疹伤寒病原--细胞内寄生(普氏、莫氏、姬姆尼次or吉姆萨染色、Vero、L929细胞、金标IFA)

流行性（普氏立克次体--体虱）、地方性斑疹伤寒（莫氏立克次体--鼠蚤）
革兰染色不易着色，姬姆尼次or吉姆萨染色。多形性：圆形、杆形、哑铃型、链型。
无芽孢&鞭毛、专性细胞内寄生。

1. 标本采集
   血标本2管。

• 枸缘酸钠抗凝→培养（细胞培养、鸡胚培养、动物接种）
• 非抗凝--分离血清→抗体检测（采2次），血块→PCR
  体虱、鼠蚤→悬液
  标本-80℃or-160℃保存

2. 病原分离
   接种动物：取血液接种2只雄豚鼠腹腔2~3 ml，39.5℃↑为特异发热。观察“阴囊红肿”（流行性-、地方性+）一只豚鼠-心血or脏器→10%SPG悬液→传代，另一只恢复期血清抗体试验。
   病人发热期血液0.5 ml→接种7日龄鸡胚→死亡后48~72 h卵黄囊染色镜检
   细胞培养法：Vero、L929细胞。病人抗凝血or白细胞层→接种单层细胞→观察细胞脱落&染色镜检。
3. 病原鉴定
   分离的立克次体，PCR鉴定
4. 快速检测
   病人急性期血液--血凝块→研磨、提取DNA→PCR
5. 抗体检测
   WHO金标方法：间接免疫荧光IFA
   血清倍比稀释→斑疹伤寒特异抗原的载玻片孔内→高倍镜or油镜观察，荧光强度以阳对为标准→最高稀释倍数为血清抗体效价。
   IgG 4倍↑ 诊断，单份IgG≥1:160现症诊断。